高效毛细管电泳法测定奶制品中三聚氰胺含量

智能文字提取功能测试中

食品科学※分析检测2010， Vol. 31， No. 02131 高效毛细管电泳法测定奶制品中三聚氰胺含量 李志伟，霍云霞，刘佳，于奕峰 (河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄 050018) 摘 要：目的：建立奶制品中三聚氰胺的含量测定方法。方法：采用高效毛细管电泳法测定，以30mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH5.0)为电泳介质，未涂层石英毛细管(75u m ×78cm， 有效长度70cm)为分离通道，紫外检测波长240nm，分离电压10kV。结果：三聚氰胺在10.0~50.0u g/mL 范围内线性关系良好， r=0.9992。平均加标回收率为97.04%，平均RSD为1.24%(n=3)。结论：该方法快速简便、灵敏度高、重现性好，可用于奶制品中三聚氰胺含量的测定。 关键词：毛细管电泳；三聚氰胺；含量测定；奶制品 High Performance Capillary Electrophoresis for Determination of Melamine in Dairy Products LI Zhi-wei， HUO Yun-xia， LIU Jia， YU Yi-feng (College of Chemical and Pharmaceutical Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018，China) Abstract： A method using high performance capillary electrophoresis (HPCE) was presented for determination of melaminein dairy products. An HPCE apparatus equipped with an untreated fused-silica capillary (75u m × 78 cm， 70 cm effective length)was used. Mobile phase was 30 mmol/L phosphate buffer at pH 5.0. UV detection wavelength was set at 240 nm and separationvoltage at 10 kV. The regression curve for peak area versus melamine concentration revealed a good linearity in the range of10.0-50.0u g/mL， with a correlation coefficient of 0.9992. The spike recovery was averaged at 97.04%， with a relative standarddeviation (RSD) of1.24% (n=3). The method exhibits characteristics of simplicity， rapidity and good repeatability， andconsequently can be used for melamine determination in dairy products. Key words： HPCE； melamine； content determination； dairy products 中图分类号：TS207.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)02-0131-03 三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂(MF)，同时广泛用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。其分子式为C3N八H6， 结构式见图1。由于其含氮量高达66.7%，添加在食品中可明显提高氮含量，造成蛋白质含量升高的假象。2007年，由于宠物食品中含有三聚氰胺导致部分宠物生病甚至死亡，美国法律禁止在食品中添加三聚氰胺，人们便开始关注三聚氰胺。2008年由于三聚氰胺出现在三鹿婴幼儿奶粉中，导致数千名婴幼儿产生不良反应甚至死亡，乳与乳制品中三聚氰胺的快速检测方法成为国内乳品企业及有关政府部门关注的焦点。以国家质检总局为主的相关政府部门连续发布了两个国家标准GB 22388—2008和GB 22400一2008。与此同时，不少公司或单位也在第一时间推出了三聚氰胺检测的解决方案，这主要包括反相高效液相色谱法(HPLC)[1-2]、反相离子对色谱法]、气相色谱- 串联质谱法[4]、液相色谱-串联质谱法I5]。相对于上述方法，毛细管电泳是一种无需采用有机溶剂、经济、高效的分离分析方法，目前已广泛应用于多种药物制剂[6-7]、蛋白质I8]及食品[9-10]的分析检测中。而采用毛细管电泳法测定三聚氰胺的方法尚未见报道。本实验采用高效毛细管电泳法测定其含量，完全可以满足奶制品安全检测的需要。 图1 三聚氰胺结构式 Fig.1 Molecular structure of melamine ( 收稿日期：2009-03-10 ) 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 奶制品 市购。 三聚氰氰标准品(批号：A0162985) 北京艾杰尔科技有限公司；实验所用其他试剂均为分析纯；缓冲液和样品溶液配制用水均使用超纯水。 1.2 仪器与设备 CL1020高效毛细管电泳仪(配有紫外检测器及HW-2000色谱工作站) 北京彩陆科学仪器有限公司；AL-204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司； KQ3200B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。 1.3 电泳条件 石英毛细管柱：75um×78cm(有效长度70cm， 未涂层)；电泳介质：30mmol/mL， pH5.0的磷酸盐缓冲液(使用前脱气)；采用重力进样，进样高度100mm，进样时间20s；分离电压：10kV；检测波长：240nm；操作温度：20℃。每次进样前依次用0.1mol/L NaOH溶液冲洗柱1min，超纯水冲洗3min，缓冲液冲洗 3min。在上述电泳条件下得到电泳图见图2。 35 时间/min 图2 三聚氰胺对照品的 HPCE 图谱 Fig.2 HPCE chromatogram of melamine standard 1.4 溶液制备 1.4.1 标准溶液的制备 精密称取100mg(精确到0.1mg)的三聚氰胺标准品，用热水溶解并定容于100mL容量瓶中，摇匀，于4℃冰箱内贮存，作为1mg/mL的标准储备液。精密吸取三聚氰胺标准储备液5.0mL，于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，该溶液为质量浓度100u g/mL 的标准中间液。 1.4.2 样品的处理及供试溶液配制 准确称取液态奶20g(精确至0.01g)，置于50mL已校正的具塞刻度试管中，加入30mL乙腈，剧烈振荡6min，加水定容至满刻度，充分混匀后静置3min，取上清液经0.45um滤膜过滤，待测。 2 结果与分析 2.1 方法学验证 2.1.1 线性关系的考察 用移液管分别移取10.0、20.0、30.0、40.0、50.0mL的标准储备液于100mL容量瓶中，用水定容，使之成为质量浓度为10.0、20.0、30.0、40.0、50.0ug/mL的三聚氰胺标准溶液。用0.45p m滤膜过滤，摇匀滤液作为对照品溶液。在上述色谱条件和色谱系统下，依次进样，以三聚氰胺的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，回归方程为Y=3.47 ×10'X-1.03×103， r=0.9992(n=5)，标准曲线见图3。结果表明，三聚氰胺在10.0~50.0u g/mL 质量浓度范围内，其质量浓度和峰面积呈良好的线性关系。 图3 三聚氰胺标准曲线 Fig.3 Standard curve of melamine 2.1.2 精密度实验 取50ug/mL的标准溶液进行测定，重复进样5次(表1)，实验测定结果为峰面积RSD 值1.23%、迁移时间RSD 值0.22%，表明该方法精密度较高。 表1 精密度实验结果 Table 1 Precision RSD ofthe method 实验号 1 2 3 4 5 RSD/% 峰面积 172470 173040 173842 178321 175364 1.23 迁移时间/min 22.507 22.468 22.513 22.559 22.593 0.22 2.1.3 重现性实验 取同一批号液态奶样品，平行测定5次(表2)，三聚氰胺峰面积RSD 值为1.34%、迁移时间RSD直为0.25%，表明该方法重现性较好。 表2 重现性实验结果 Table 2 Reproducibility RSD of the method 实验号 1 2 3 4 5 RSD/% 峰面积 166374 166879 169273 171685 166788 1.34 迁移时间/min 22.440 22.457 22.542 22.568 22.478 0.25 2.1.4 加标回收实验 精密量取液态奶样品16.0、20.0、24.0g，分别加入50.0u g/mL 三聚氰胺标准溶液1mL， 按供试品溶液的配制方法制得所需溶液，测定其峰面积，结果见表3。可知，平均加标回收率为97.04%，平均RSD为1.24%。 表3 回收率实验结果 Table 3 Average spike recoveries and RSD 样品加 标准品 测得量/ 回收率/ 平均回 RSD/ 入量/g 加入量/ug u g % 收率/% % 16.0521 50.0 49.5268 99.05 16.1569 50.0 48.9502 97.90 98.96 1.02 16.0213 50.0 49.9650 99.93 20.0177 50.0 48.6654 97.33 20.0083 50.0 48.4051 96.81 96.35 1.32 20.0125 50.0 47.4556 94.91 24.1530 50.0 47.4451 94.89 23.9843 50.0 47.5957 95.19 95.80 1.38 24.1002 50.0 48.6655 97.33 2.2 实际样品测定 在空白样品中添加适量三聚氰胺标准品，按1.4节的方法处理，测定峰面积并计算含量，结果(图4、5)表明本方法的最低检出限为 2mg/mL。 图4 空白样品的 HPCE图谱 Fig.4 HPCE chromatogram of a spiked sample 图5 加标样品的 HPCE图谱 Fig.5 HPCE electrophoregram of standard addition sample 2.3 讨论 2.3.1 缓冲液类型的选择 在相同的离子浓度条件下比较了磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和硼砂-磷酸缓冲液3种缓冲盐体系，实验发现磷酸盐缓冲液对三聚氰胺的分析效果较为理想，实验选择了磷酸盐缓冲液作为分离条件。 2.3.2 缓冲液离子浓度的选择 缓冲液离子浓度对峰型和迁移时间有一定影响。实验选择了10.0、20.0、30.0、40.0mmol/L四种离子浓度的磷酸盐缓冲液，随着离子浓度的增大，三聚氰胺的迁移时间延长，色谱峰变宽。这可能是由于缓冲液离子浓度的增大导致溶液黏度增大，同时引起双电层厚度减 小，使电渗流(EOF)减小，从而导致迁移时间延长。综合考虑峰型和分析时间等因素，实验选择了30.0mmol/L磷酸盐缓冲液作为最佳条件。 2.3.3 缓冲液pH值的选择 缓冲液的pH值对分离有较大的影响。溶液pH 值的大小影响毛细管表面特性及柱壁与溶质的电荷差异，从而改变其相互作用，影响分离度。实验考察了缓冲液pH值分别为2.0、4.0、5.0、6.0、7.0时三聚氰胺的分离情况。随着缓冲液的pH值的升高， EOF 增大，出峰时间缩短，但峰形较差。当pH值为5.0时，三聚氰胺获得较好的分离。 2.3.4 分离电压的选择 分离电压主要影响的分离度和分析时间。随着分离电压的增加，毛细管轴向的电场强度增强，可以增大柱效，缩短分离时间。但在增加电压的同时，柱内的焦耳热增加，引起柱效和分离度的降低。实验选择了5、8、10、15kV作为分离电压，随着电压的增加，组分的迁移时间缩短，分离度有所下降。为了在保证分离度的条件下，在较短的时间内获得最佳的分离效果，本实验选择10kV作为分离电压。 3 结 论 电泳缓冲液采用30mmol/L磷酸盐缓冲液(pH5.0)使得三聚氰胺与液态奶中其他组分达到基线分离，并且峰型较好，能够满足奶制品中三聚氰胺含量测定要求。该方法具有柱效高、分析速度快、精密度高、重现性好等优点，对于定量分离分析奶制品中三聚氰胺，优于成本较高和前处理复杂的高效液相色谱法，为三聚氰胺的分析检测提供了一种良好的方法。 ( 参考文献： ) ( [1] 宫小明，董静，孙军，等. HPLC法测定植物性原料中 三 聚氰胺[] . 食 品科学，2008，29(4)：321-323. ) ( [2] 倪沁颜.高效液相色谱法(HPLC)测定饲料中三 聚 氰胺的含量[J].福 建分析测试，2008，17(1)：59-59. ) ( [3] 俞建君，吴芳珍.反相离子对色谱法测定工业三聚氰胺含量[J].广 东化工，2007，34(7)：126-127. ) ( [4] 王征.GC-MS法则定动物食品中的三聚氰胺[].福建分析测试，2008， 17(2)：1-4. ) ( [5] 李爱军，张代辉，马书民，等.液相色谱-串联质谱法测定饲料中三 聚氰胺残留[].分析化学，2008，36(5)：699-701. ) ( [6] 王艳红，檀华蓉，祁克宗，等.高效毛细管电泳同时测定4种氟喹诺酮类抗菌药[J].中国兽药杂志，2007，41(11)：8-11. ) ( [8] 王忠慧，王惠民，王跃国.毛细管电泳在脂蛋白分析中的应用[].现代检验医学杂志，2005，20(4)：82-85. ) ( [7] DANEL C， BARTHELEMY C， AZARZAR D， et a l. Analytical andsemipreparative enantiosepararion of 9-hydroxyriperidone， the mainmetabolite of risperidone， using high-performance liquid c hromatogra-phy and capillary electrophoresis validation and determination of enan-tiomeric purity[J ] . Journal of Chromatography A，2007，1163 ： 228-236. ) ( [9] 张晓玲，杨桥，吴文惠，等.食品黑色素毛细管电泳法分析新方法建 立 [].食品科学，2008，29(6)：372-375. ) ( [10] M ATTEO B， MARCO P， TULL I A G Y， et al. Analysis of green t e acatechins： comparative study between HPLC and H P CE[J]. F o odChemistry， 2003，81(4)： 631-638. ) 作者简介：李志伟(，男，副教授，博士，主要从事药物分析和分离材料研究。E-mail： Leezhw@tom.com◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net