液相色谱-串联质谱在食品安全检测方面的应用

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河北师范大学 94.8%， RSD范围在2.4-3.6%。 硕士学位论文 液相色谱-串联质谱在食品安全检测方面的应用 姓名：李飞 申请学位级别：硕士专业：微生物学 指导教师：赵宝华；李玉国 20090406 要 β-受体激动剂、玉米赤霉醇、糖皮质激素类、类固醇类激素在畜牧养殖业中又可叫激素类活性物质，一般用于添加到饲料中，提高畜禽的生长速率、饲料转化率和瘦肉比率，或被用于治疗家畜的疾病等。长期摄入这些物质，会引起人体性机能紊乱及影响第二性征的正常发育，引起一系列疾病甚至致癌；并且这四类物质是国际奥委会明令禁止的兴奋剂类药物。三聚氰胺属于一种化工原料，被不法分子添加到原奶中以提高蛋白含量，造成三聚氰胺重大食品安全事件，影响恶劣，对全国婴幼儿健康造成威胁。因此迫切需要建立起快速、灵敏、准确的检测方法。 本文综述了四类(β-受体激动剂、玉米赤霉醇、糖皮质激素类、类固醇类激素)25种兴奋剂在生鲜肉、牛奶、鸡蛋中残留问题和分析方法的现状、发展和趋势，介绍了乳及乳制品中三聚氰胺的残留，危害。简单介绍了液相色谱-串联质谱的原理、特点和应用。并就兴奋剂和三聚氰胺在食品中的残留的分析方法和应用进行了系统研究主要结果如下： 1.建立了生鲜肉、牛奶和鸡蛋中四类兴奋剂残留的液相色谱-串联质谱检测方法，分析前处理过程，优化了色谱与质谱条件，应用检测省食药局检测的供奥56批次肉类样品，β-受体激动剂检出限为0.25 u g/kg，方法回收率在 75.4-102.8%之间， RSD 介于2.4-5.8%之间；玉米赤霉醇检出限为 0.5 u g/kg， 方法回收率在84.5-103.7%之间， RSD 介于2.8-4.7%之间；糖皮质激素检出限为 0.2 ug/kg， 0.5 u g/kg， 1.0ug/kg，方法回收率在85.0-96.4%之间， RSD 介于2.3-4.1%之间；类固醇类激素检出限为 0.3 ug/kg， 0.4g/kg，方法回收率在 89.1-102.5%之间， RSD 介于2.4-5.1%之间。 2.建立了乳及乳制品中三聚氰胺残留量测定的液相色谱-串联质谱方法，优化了色谱及质谱条件，应用于三鹿婴幼儿奶粉重大安全事故最初排查阶段的500个批次原奶、液态奶、奶粉和酸奶的检验，检出限为0.01mg/kg， 方法回收率在82.4-95.7%之间， RSD介于 2.3-3.1%之间。为政府部门提供了第一手资料，为地方标准的建立确立了最初条件和原始数据。 关键词：液相色谱-串联质谱食品安全检测兴奋剂三聚氰胺 Abstract B-receptor agonist， zearalanol， glucocorticoids， steroid hormones are also called activesubstances in the animal husbandry industry. They are generally added to the feed， and usedto raise the poultry growth rate， feed conversion rate and lean meat ratio or for the treatmentof livestock diseases. Long-term intake of these substances will cause to human sexualfunction disorders and impact the normal development of secondary sexual characteristics，causing a series of diseases and even cancer. These four substances are prohibited by theInternational Olympic Committee. Melamine is a chemical raw material， and was added tooriginal milk by lawless elements. This will lead to significant food safety case of melamine，which pose a threat to the infants and young children. There is an urgent need to establish arapid， sensitive and accurate detection method for it. In this research， the analysis method of 25 kinds of stimulants in fresh meat， milk，eggswas reviewed， and the trends of them were also discussed. The harm of residue melamine inmilk and dairy products was introduced. The principles， characteristics and applications ofliquid chromatography- tandem mass spectrometry was also introduced. The researches ofthe analysis and application of stimulants and melamine residue in food are as follows： 1.The method for screening four kinds of stimulants in fresh meat， milk and eggs wasestablished. The process of the treatment of samples before analysis was also established.Moreover， the conditions of chromatography and mass spectrometry were optimized. For 56meat samples which were supported to Olympic Games， the detection limit of p-receptoragonist was o.25ug/kg， the rate of recovery was between 75.4% and 102.8%， and RSD valuewas between 2.4% and 5.8%. The detection limit of zearalanol was 0.5ug/kg， and the rate ofrecovery was between 84.5% and 103.7%， RSD value was between 2.8% and 4.7%. Thedetection limit of glucocorticoid was 0.2ug/kg， 0.5ug/kg and 1.0ug/kg， and the rate ofrecovery was between 85% and 96.4%， RSD value was between 2.3% and 4.1%. Thedetection limit of steroid hormones was 0.3ug/kg， 0.4ug/kg， and the rate of recovery wasbetween 89.1%and 102.5%， RSD value was between 2.4% and 5.1%. 2.The method of analysis of melamine residues in milk and dairy products by liquidchromatography-tandem mass spectrometry was established. The conditions ofchromatography and mass spectrometry were optimized. The method was applied to detect500 batches of the original milk， liquid milk， milk powder and yogurt， the detection limit was0，01mg/kg， the rate of recovery was between 82.4% and 95.7%， RSD value was between2.3% and 3.1%.These results provided the first-hand information to government departmentsand provided the initial conditions and data to set up a local standard. Keyword： LC-MS/MSyFhoodsafty detectionStimulant Melamine 学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文《液相色谱-串联质谱在食品安全检测方面的应用》，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果出本人承担。 论文作者(签名)：李k 指导教师确认(签名)： 2559年5月2日 年月2 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在 年解密后适用本授权书) 论文作者(签名)：李指导教师(签名)：209年月23日年月日 前言 液相色谱-串联质谱是二十世纪八十年代发展起来的一种分析方法，它结合了液相色谱分析的高分离性和质谱分析的高灵敏性，已广泛应用于食品科学、生命科学、化学、环境科学和医药卫生领域的微量检测方面。 随着人民生活水平的提高，环境保护与食品安全问题已经成为人们日益关注的问题。我国的食品安全形式不容乐观，近年来出现的一系列重大食品安全事件为我们敲响了警钟，食品安全检测已成为食品“从农田到餐桌”的重要环节。 2008年奥运会，河北省食品安全质量监督检验研究院(下简称食品院)作为河北省两家具有四大类兴奋剂检测能力机构之一，承担了某供奥企业动物源食品的批批检验工作，需确立快速、简便、灵敏、准确的检测方法。在已有的方法中，酶联免疫法、HPLC方法的灵敏度较低，选择性和特异性差，不适合用于奥运会食源性兴奋剂检测的要求，气一质联用方法虽然灵敏度和特异性都很高，可以满足残留分析的要求，但对付合成类固醇激素和糖皮质激素还需要经衍生气化后检测，过程繁琐。因此，选取液相色谱-串联质谱方法，并优化前处理过程及色谱质谱条件，建立一套完整的快速、灵敏、准确的测定25种兴奋剂的方法，具有重要的现实意义。2008年9月爆发的三聚氰胺重大食品安全事件，更考验了食品院应付突发事件的能力，在上级机构的要求下，食品院承担了从紧急排查、抽查、复核及批批检验一系列工作，从头摸索条件，对比方法，最终建立了液相色谱-串联质谱检测乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法，为政府部门提供了第一手资料，也为河北省三聚氰胺地方标准的建立提供了数据和条件。 第一章文献综述 1.1 液相色谱-串联质谱技术简介与发展 1.1.1液相色谱-串联质谱接口技术简介 高效液相色谱和质谱的联用首先要解决的问题是接口真空匹配的问题。质谱的工作真空一般要求为105Pa， 要与在常压下工作的液质接口匹配并维持足够的真空，只能增加真空泵的抽速，维持一个必要的动态真空"。 除真空匹配之外，液质联用技术的发展可以说就是接口技术的发展。API 接口是目前商品化 LC/MS 仪器采用最广泛的接口[2-4]。常规的质谱电离技术电离样品是在高真空下进行， 即在连接 LC 和 MS 时，为避免溶剂进入离子源破坏真空，在样品进入离子源之前将溶剂去除。API 技术是大气压状态下的电离技术，1它用于连接 LC 和MS时， LC柱后流出物首先在大气压下电离，然后带电离子从溶剂中分离出来进入高真空的质谱[5.6] 1.1.2大气压电离(API)接口的离子化机制 API 接口主要包括两种：电喷雾(ESI)接口和大气压化学电离接口(APCI)两种。 1.1.2.11电喷雾接口 离子化过程包括初始带电液滴的形成和随后的带电液滴连续裂变两个过程。经由喷口进入喷雾室的被分析物溶液在一定流速和几何形状的喷雾气体作用下形成直径为1-3Im的液滴。溶剂的脱去和电荷密度的持续增加使液滴分裂成为更小的液滴来降低电荷密度并达到一定直径下的新的电荷密度的稳定态。裂变过程的电荷不均匀分布使液滴带上电荷[8-11]。 1.1.2.2大气压化学电离(APCI)接口 液相色谱流出液喷雾时， 3-6kV电压的尖针在雾中放电，使溶剂电离，形成反应气 等离子体，样品经过等离子体时，通过质子转移，电离成离子，并进入质谱分析室测定[12-13]. 1.1.3质谱技术的发展 在质谱/质谱(MS/MS)中，有3种扫描方式，即子离子扫描、母离子扫描及中性丢失扫描[15-16]。利用子离子扫描可以研究某一个特定化合物的结构，利用母离子扫描可以研究一组相关的化合物，利用中性丢失扫描则可在复杂混合物中寻找具有相同官能团的系列化合物.在扇形磁质谱仪中，可用加速电压、静电场、磁场的联动扫描完成上述功能。在3级4极矩仪器中，通过分析器的简单线性扫描即可完成上述3种功能。无论在哪种类型的质谱一质谱仪中，都已广泛采用了碰撞诱一导分解(CID)技术[16]。 1.1.4液相色谱-串联质谱的应用 1.1.4.119液相色谱-串联质谱在兽药残留检测的应用 目前国际上比较重视的残留药物有抗生素、激素类、磺胺类、呋喃类、喹诺酮类和转基因类药物，有文献报道盐酸克伦特罗[17、磺胺I18、喹诺酮[19、大环内酯I20]和孔雀石绿[21]等几种动物源食品兽药残留的液相色谱-串联质谱检测方法，方法简便，检出限低，符合国际上的要求。 1.1.4.2液相色谱-串联质谱在农药残留检测的应用 过去对农药残留的检测一般采用气相色谱-质谱法，但并不适用于热不稳定或难挥发的农药。并且需要衍生化样品提取液，步骤繁琐，而液相色谱-串联质谱方法克服这一缺点，并且在特异性和灵敏度上能达到更高的要求，所以应用到更多的农药残留检测中，如氨基甲酸酯[22]、有机磷[23]和除草剂I24]等 1.1.4.3液相色谱-串联质谱在食品添加剂检测的应用 食品添加剂分析中的研究主要集中在利用色谱法对食品添加剂的定性定量检测和多种添加剂同时检测。近年来的热点问题如色素(25]、甜味剂[26和抗氧化剂[271等都有报道。 1.1.4.4液相色谱-串联质谱在生命科学的应用 液相色谱与电喷雾电离串联质谱仪的偶联(LC/ESI/MS/MS)， 能快速灵敏地测定多肽或蛋白质的部分氨基酸序列，并可鉴定多肤侧链中存在的修饰位点(如糖基化、磷酸化、乙酸化、硫酸化等)以及蛋白或多肤分子中二硫键的定位[28-29)。用液相色谱-串联质谱技术研究究糖、寡核苷酸、核酸等也有很多报道[30-31)。 1.2兴奋剂的简介 1.2.1兴奋剂发展历史 由于运动员为提高成绩而最早服用的药物大多属于兴奋剂药药——刺激剂类，所以尽管后来被禁用的其他类型药物并不都具有兴奋性(如利尿剂)，甚至有的还具有抑制性(如β-阻断剂)，国际上对禁用药物仍习惯沿用兴奋剂的称谓。目前际奥林匹克运动委员会规定：“竞技运动员使用任何形式的药物和以非正常量或通过不正常途径摄入生理物质，企图以人为的或不正常的方式提高竞技能力即被认为使用了兴奋剂”[32]。 19世纪，南非的荷兰定居者们非常熟悉一种提炼自葡萄皮的酒精饮品，祖鲁族武士奔赴战场前都要喝一点以提高战斗力和耐力。在宗教仪式中，这种叫做“dop”的混合物也被当作麻醉剂使用。20世纪和21世纪之交，英语借用了该词，并首次将“doping”(兴奋剂)与赛马时的非法药物联系在了一起。 早在20世纪50年代，兴奋剂在国际体坛上已被广泛使用，尤其是苯丙胺，曾经风靡一时。1886年，一位自行车运动员因过量使用兴奋剂致死，成为第一例有文字记载的因服用兴奋剂死亡的事件。时至今日，尽管国际体坛进行了积极的反兴奋剂运动，但兴奋剂的使用仍是有增无减，而且使用方法更加巧妙，隐蔽。据有关方面估计，目前世界各国一流选手中有6%的人使用兴奋剂。在2000年悉尼奥运会期间，共有11名运动员在赛内和赛外药检中被查出使用了兴奋剂。据不完全统计，在奥运会举行前，世界各国还有50余名选手因为药检不合格未赴悉尼，在运动员抵达悉尼后的开赛前和比赛期间，又至少有16名运动员因以前的药检阳性结果而被驱逐出奥运村或被禁赛。 不仅如此，兴奋剂的种类也从化学物质发展为可怕的基因物质[33]，兴奋剂对运动员的危害及危害的机理存在着很大程度上的不可知性，兴奋剂的监测也面临着严峻的挑战。 1.2.2兴奋剂在畜牧养殖业的作用 兴奋剂在畜牧养殖业上又可以叫激素类活性物质，上世纪70年代，美国开始把它应用于养殖业，促进畜禽和水生动物的生长，提高饲料转化率[34-36]。在特定的饲养条件下，动物饲喂期间可引起动物蛋白质的沉积，从而提高饲料转化率，增加瘦肉率，促生长幅度可达 10~40%。但这类激素类活性物质在动物体内容易造成残留，并通过食物链进入人体会产生一系列的内分泌失调、引起肿瘤、生长发育障碍、出生缺陷和生育缺陷等方面的健康效应，给人体健康带来深远影响，而且多数激素类物质具有潜在的致癌性。 1.2.3本文研究的兴奋剂分类 1.2.3.1 β-受体激动剂：包括特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗和喷布特罗。 其中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇和喷布特罗对支气管平滑肌具有较强而持久的扩张作用，一般临床用于治疗支气管哮喘，喘息性支气管炎，肺气气等。克伦特罗即我们平常所说的瘦肉精，它和莱克多巴胺可减少脂肪囤积，增加肌肉含量，其短期效应和安非他明、麻黄碱等兴奋剂类似，会使得心律变快、血压升高、发热，，一些运动员非法服用该药以获得这种热量和抗代谢效应，提高肌肉力量[37-40]。20世纪80年代初，9-一家美国公司开始将其添加到饲料中，提高畜禽的生长速率、饲料转化率和瘦肉比率，由于使饲养动物长得快，体型好且瘦肉比例高而获得较高的经济回报。但盐酸克伦特罗作为饲料添加剂用量大、时间长、代谢慢，在肉和内脏残留量很大。一次摄入量过大，会出现四肢颤抖、心跳加速、口干多汗、头晕头痛、心悸、恶心呕吐等中毒症状。在中国瘦肉精虽早已被禁用，由于经济回报高，仍有违法冒险滥用现象。 1.2.3.2玉米赤霉醇：包括α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤赤烯醇、β.玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮。 作为牛羊增重剂可促进生长，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率及饲料转化率，同样有助于运动员提高肌肉力量之用。但玉米赤霉醇具有弱雌激素作用，经动物排出体外后，还可经饮水和食物造成二次污染及环境污染。其残留会引起人体性机能紊乱及影响第二性征的正常发育，可能致癌[41-43]，所以我国明确禁止玉米赤霉醇用于所有食品动物。但 由于玉米赤罐醇作为牛羊增重剂效果好，经济回报高，仍有违法使用的现象。 1.2.3.3 糖皮质激素类：包括泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松、倍氯米松、氢化可的松。 糖皮质 (glucocorticoid)是由肾上腺皮质中束状带分泌的一类甾体激素，主要为皮质醇(cortisol) 具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢的作用，还具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒、抗休克作用。称其为“糖皮质激素”是因为其调节糖类代谢的活性最早为人们所认识。合成类糖皮质激素属于畜产品常用的药物，它常被用于治疗家畜的炎症反应、免疫性疾病、牛的酮病等。合成类糖皮质激素普遍的非法用途是用于增加家畜的饲料摄入量从而使其达到增重的目的。长期摄入糖皮质激素可造成人体多种不良反应，如水盐代谢紊乱，消化系统及心血管系统并发症，骨质疏松及椎骨压迫性骨折，神经精神异常等[44-47)。 1.2.3.4 合成类固醇类激素：包括睾酮、年甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮和苯丙酸诺龙。 合成类固醇类激素具有促进蛋白质合成的作用，可以使肌肉增大和力量增强。但长期使用或摄入合成类固醇类激素对人体有极大危害：严重破坏了体内荷尔蒙系统，类固醇严重地打乱了体内正常的荷尔蒙的产生，引起可挽回或不可挽回的身体变化，导致男性出现睾丸萎缩、胸部扩大、早秃、肝、肾功能障碍或肝肿瘤，女性出现雄性化，月经失调、肌肉增生、毛发增多等；严重破坏了骨骼肌系统。不断增长的睾丸激素和其它性激素可以使青少年的身体成长非常快。然而，当荷尔蒙在到某种水平时，它会使骨骼停止生长，永远不会再有身高上的变化；严重破坏了心血管系统。类固醇可以人引发一些心血管疾病，比如心脏病和中风。因为它可改变体内脂蛋白的水平(脂蛋白起到把胆固醇带入到血液中的作用)。尤其是口服类的类固醇可以提高低浓度指蛋白水平，却降低了高浓度脂蛋白的水平，这样就会使脂类物质储存在动脉中，阻碍了血液循环。如果血液不能正常到达心脏，那么，就会引起心脏病发作；如果血液不能正常到到大脑，那么就会引起中风[48-50]。合成类固醇在畜牧业、体育运动和保安业中一直被广泛的非法使用。1988年汉城奥运会男子百米赛跑冠军约翰逊就因为类固醇检测阳性而被取消金牌。 这4类禁药都有促进蛋白质合成，提高肌肉含量(力量)，或者调节脂肪代谢的作 用，用于饲养动物可以加快动物生长速度，提高肉类产量，从而达到更好的经济效益。这些禁药就这样悄悄潜入到我们的餐桌上，进入我们的身体中，危害我们的健康；同时也成为食源性兴奋剂，潜在威胁着运动员的声誉和成绩，威胁着绿色奥运会。 1.2.4兴奋剂的危害和管理 人们比较熟悉的“瘦肉精”即克伦特罗危害较大，1997年香港就发生过大陆供港猪内脏引起人中毒的事件。2006年发生过包括上海广东在内全国各地先后300多人瘦肉精中毒事件，轰动一时。2008年6月，我国著名游泳运动员欧阳鲲鹏因为吃小摊烧烤，尿液赛后药检查出违禁成分“瘦肉精”，造成终身禁赛的悲剧。 我国农业部已对禁用上述禁药发出过公告，早在1997年农业部就发出过通知-畜牧生产禁用“玉米赤赤醇”， 2008年3月，农业部公告第193号规定了21种食品动物禁用的兽药及其它化合物清单，其中β-受体激动剂类包括克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗及其盐、酯及制剂；雌激素类包括玉米赤霉醇及制剂；性激素类包括甲基睾酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙及其盐、酯及制剂。 1.3兴奋剂检测研究进展 奥运会赛后兴奋剂的检测是从1968年冬季奥运会开始的。最初禁用的药物仅有8种，以后根据运动员的服药情况以和药物性质，历届奥运会禁用药物的品种和数量都有增加：1972年禁用26种，1976年31种，1980年58种，1984年69种，1988年增加β一阻断剂和利尿剂类药物，总计达5大类，100种；1990年，国际奥委会医学委员会对禁用药物名单作了修改，禁用103种药物及1种药理方法禁用药；1992年，又增加了2种刺激剂类禁用药物。1992年后主要集中在内源性肽类激素，它们包括促红细胞生成素(EPO)、人体生长激素(hGH)等，目前随着基因技术的发展，转基因食品将会是未来兴奋剂的趋势。 自1968年国际奥委会禁用兴奋剂以来，兴奋剂的检测主要以气相色谱-质谱(GC-MS)、气相色谱(GC)及液相色谱(HPLC)为主，液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、酶联免疫 (ELISA) 等联用技术在药物分析、法医学、商检、环境科学、生命科学等领域的广泛应用和蓬勃发展，也不可避免地带动了兴奋剂检测方法的改进与发展51-54]。 其中，由于酶联免疫法、HPLC方法的灵敏度较低，选择性和特异性差，不适合用于奥运会食源性兴奋剂检测的要求。气-质联用方法虽然灵敏度和特异性都很高，可以满足残留分析的要求，但对付合成类固醇激素和糖皮质激素还需要经衍生气化后检测，过程繁琐。液相色谱一质谱法是分析动物源性食品中痕量药物残留的重要方法，灵敏度高，选择性和特异性好，能够对低浓度的样品进行很好的确认。可用于测定不同食品基质中的兴奋剂检测。 液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术始于20世纪70年代，但直到20世纪80年代中后期大气压电离技术(API)得到发展且逐渐成熟后， LC-MS 才得以迅速发展，并很快成为科研和日常分析的有力工具[55-58]。但LC-MS 虽然有足够的灵敏性，但遇上LC 难以分离的组分，其作用要受到限制，随着四极杆离子阱质谱仪及串联质谱仪作为质量分析器的技术发展成熟，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)可以相对有效地克服背景干扰，通过MS/MS 的选择离子对模式来提高信噪比，使得检测更加灵敏[59]。 第二章 液相色谱-串联质谱在兴奋剂检测上的改进与应用 基质效应是影响液相检测灵敏性的重要因素，本实验所采取的液相色谱-串联质谱方法选择性较强，在一定程度上减小了基质效应的影响，所以实验重点主要集中在前处理过程中对于待测物质的提取和净化，常规动物源食品中，脂肪和蛋白质是主要干扰物质，在奥运批批检验样品中除了常规生鲜肉制品、乳制品和鸡蛋等，增加了速冻调制肉制品，他被人为添加大量淀粉、脂肪等物质，造成基质情况更加复杂，基质中与待测物质同时洗脱出的杂质常常对分析物电离造成影响，使待测物质信号被抑制或增强，造成准确性降低，本方法采取了高速冷冻离心的新方法去除淀粉；在纯化过程中采取的的吹浓缩大大降低了成本，经空白添加试料回收率实验证明，损失微小，符合要求。将基质效应最大限度降低。 2.1β-受体激动剂残留检验 2.1.1仪器与试剂 液相色谱-串联质谱仪： Agilent 1200-6410；色谱柱： BEHC8色谱柱；分析天平：BS200S；冷冻高速离心机： CT-RT15；氮吹仪： N-EVAP112； 乙酸铵缓冲液(0.2mol/L)、高氯酸(70%-72%)、高氯酸溶液(0.1mol/L)、氢氧化钠溶液(10mol/L)、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、I甲酸水溶液(2%)、氨水甲醇溶液(3%)和甲醇-0.1%甲酸溶液(10+90， V/V)均为分析纯，，β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，色谱纯甲醇，β-受体激动剂标准物质包括特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗和喷布特罗，用甲醇分别配制成100pg/mL的标准储备液，-20℃冰箱中保存，有效期为6个月。 2.1.2样品处理 准确称取2g组织试料于50mL离心管中，加入 0.2mol/L 乙酸铵溶液(pH=5.2)8.0mL，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶 40uL， 涡旋混匀，于37度下避光水浴振荡16h。 酶解后放置至室温，涡旋混匀， 10000rpm 高速离心10min，倾出上清液于另一50mL 离心管内，加入 0.1mol/L 高氯酸溶液 5mL， 涡旋混匀，用高氯酸调 pH至1.0±0.2，10000rpm 离心 10min 后，将上清液转移至另一 50mL 离心管内。用 10mol/LNaOH溶液调pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15mL，涡旋混匀，并振荡 10min， 5000rpm离心 5min，取出上层有机相至另一 50mL 离心管内。再在下层水相中加入叔丁基甲醚10mL，涡旋混匀，并振荡 10min， 5000rpm 离心5min， 合并有机相，50℃下氮气吹干，用2%甲酸溶液5mL 溶解，，备用。 MCX固相萃取柱依次用甲醇、水、2%甲酸溶液各 3mL 活化，取备用液全部过柱，再依次用2%甲酸溶液、甲醇各3mL淋洗，抽干，用3%氨水甲醇溶液 2.5mL洗脱； 洗脱液在50℃下用氮气吹干。 残余物用甲醇-0.1%甲酸溶液(10+90，V/V) 0.2mL溶解，涡旋混匀，15000rpm 高速离心 10min，取上清液适量，供液相色谱-串联质谱仪测定。 2.1.3测定 2.1.3.1液相色谱条件 色谱普： BEHC18色谱柱， 50mm×2.1，粒径1.7um；流动相：A相：B相，梯度洗脱程序见表1；A相：0.1%甲酸乙腈溶液 B相：0.1%甲酸水溶液 柱温：30℃；进样量：10uL。 2.1.3.2质谱条件 离子源：：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测； 电离电压：3200V；源温：：110℃；雾化温度：350℃；锥孔气流速： 50L/h；雾化气流速：：650L/h； 药物保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表2 表1流动相梯度洗脱条件和流速 TAB.I Mobile phase gradient elution conditions and the flow rate 时间(min) 流速(mL/min) A相(%) B相(%) 0 0.30 96 2 0.30 4 96 12 0.30 60 40 12.1 0.30 4 96 16 0.30 4 96 表2： 6种β-受体激动剂保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量 TAB.2 Six kinds of β-receptor agonist retention time， qualitative and quantitative ion-pair andhole cone voltage， collision energy 药物名称 保留时间 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量 (min) 特布他林 1.94 226.15>124.67 226.15>151.74 25 22 226.15>151.74 15 西马特罗 1.98 220.18>201.95 220.18>201.95 20 10 220.18>129.77 16 沙丁胺醇 2.08 240.17>147.70 240.17>147.70 22 18 240.17>221.97 10 莱克多巴胺 4.96 302.33>106.77 302.33>163.87 25 28 302.33>163.87 15 克伦特罗 5.38 277.11>202.78 277.11>202.78 25 15 277.11>258.94 10 喷布特罗 8.76 292.36>236.22 292.36>236.22 30 15 292.36>201.00 20 2.1.3.3测定 取试料溶液和空白添加标准溶液，作单点点准，外标法计算。 2.1.4结果 2.1.4.16种β-受体激动剂标准物质色图谱 6种β-受体激动剂标准物质色谱图见图1。从图1可看出6种β-受体激动剂的出峰时间依次为 2.449、7.516、8.648、7.256、2.104和2.134min。 图16种β-受体激动剂标准物质色谱图 Fig.1 Six kinds of standard p-receptor agonist substance chromatogram 2.1.4.26种标β-受体激动剂准物质质谱图 6种β-受体激动剂准物质质谱图见见2-7。a列为出峰时间：对应图1的色谱图；b列为两种子离子碎片比例；c列为碎片离子峰图，在相应的保留时间段中，代表这种物质荷质比的母离子与两种子离子碎片响应值符合定性与定量离子对条件。 Taget Compound Cimateolr(西马特罗) Taget Compound Clenbuterol(克伦特罗) Taget Compound Penbutolol (喷布特罗) Taget Compound Rackdopamine(莱克多巴胺) Taget Compound Sabutamol(沙丁胺醇) Taget Compound Turbutaline(特布他林) a b c 图2-7β-受体激动剂准物质质谱图 Fig.2-7 Six kinds of p-receptor agonist mass spectrum of standard material Counts：响应值 Acquisition Time：保留时间 Relative Abundance：碎片离子比例 Mass-to-Charge：质合比 2.1.4.3前处理过程的优化 2.1.4.3.1酶解的重要性 B-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶的作用是将β-受体阻断剂分解为易被提取液提取的小分子肽类物质，经空白添加试料回收率试验结果证明酶解比不酶解回收率提高40%。 2.1.4.3.2提取液与缓冲液的选择 本文最终选取乙酸乙酯和叔丁基甲醚共同作为提取液。 样品中的脂肪与蛋白质通过酸性条件下高速冷冻离心去除。 2.1.4.3.3 pH的调节 乙酸乙酯提取时需要碱性环境，而前面去除脂肪和蛋白质的高速冷冻离心步骤则需 要酸性条件，因此先用高氯酸将 pH调成1.0，然后再用 10mol/LNaOH溶液将 pH调成9.5 2.1.4.3.4固相萃取柱的选择 B-受体激动剂的浓缩与净化可通过固相萃取来完成，一般采取联合使用，即反相固相萃取柱如 HLB、C18、C8等进行浓缩，正相固相萃取柱如氨基柱、氧化铝柱、硅胶柱等进行净化。本文从多方面考虑，最终使用氮气吹千方法进行提取液的浓缩，虽然在吹干过程中可能使β-受体激动剂有一定损失，但在后面的空白添加实验回收率证明此损失在忽略范围内，这样可大大节约成本，较适合在一般检测机构应用。选取 MCX固相萃取柱进行净化。 2.1.4.4色谱条件的优化 2.1.4.4.1色谱柱的选择 C18 柱是目前β-受体激动剂检测常用的液相色谱柱，本文采用了 BEHC 色谱柱，规格为 50mm×2.1，粒径1.7um。 2.1.4.4.2流动相的先取 本文通过一系列预实验，得出在甲酸含量为0.1%时，β-受体激动剂的响应值最高，所以采用了乙腈+0.1%甲酸为流动相。 2.1.4.5方法检出限 将不同浓度的β-受体激动剂标准溶液添加到空白样品中，配制成浓度较低的一组样品，按照样品前处理步骤每种浓度重复10次，进行3次单独试验。以30次测定结果的信噪比均大于10的最小浓度为定量限。以30次测定结果的信噪比均大于3的最小浓度为检测限。 特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗和喷布特罗检出限为0.25u g/kg、定量限为 0.5 ng/kg。 2.1.4.6空白试料添加标液回收率 选取空白试料添加各浓度β-受体激动剂标液，使空白试料最终含含β-受体激动剂浓度为2.0u g/kg， 按前处理方法提取、净化后上机测定，重复10次进行实验，外示法计算回收率和相对标准偏差，结果见表3，可见，6种β-受体激动剂的回收率范围在75.9. 表3β-受体激动剂空白试料添加标液回收率 Tab.3p-receptor agonist S add a blank sample liquid recovery β-受体激动剂 最终浓度(ug/kg) 回收率(%) RSD(%) 西马特罗 2 75.9 2.4 克伦特罗 2 85.0 3.6 喷布特罗 2 81.2 3.1 莱克多巴胺 2 94.8 2.5 沙丁胺醇 2 75.4 5.1 特布他林 2 102.8 5.8 2.1.5样品检测 利用本方法对抽检56个奥运动物源性食品进行检测，用保留时间和检出峰的光谱图进行定性分析，均未检出β-受体激动剂。代表样品分离色谱图如图8由图8可知：在6种β-受体激动剂出峰时间范围内无可疑峰出现，证明样品中不含β-受体激动剂。 图8样品分离色谱图 Fig.8 Samples separation chromatogram 2.2牛奶中玉米赤霉醇残留检测 2.2.1仪器与试剂 液相色谱-串联质谱仪： Agilent 1200-6410；色谱柱： BEHC色谱柱：分析天平：BS200S；冷冻高速离心机： CT-RT15；氮吹仪： N-EVAP112： 甲醇、正己烷、乙腈、乙酸均为色谱纯，乙酸乙酯、氢氧化钠、硫酸、无水硫酸钠、氨水均为分析纯，正己烷-乙酸乙酯(60+40：20+80， v/v)，玉米赤霉醇标准物质包括a-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、a-玉米赤霉烯醇、B-玉米赤烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮，甲醇分别配制成100ug/mL 的标准储备液，-20℃冰箱中保存，有效期为1年。 2.2.2样品处理 准确称取5g组织试料于 50mL 离心管中，加入甲醇15mL， 涡旋混匀 1min，4000rpm/min 离心 10min， 倾出上清液于另一 50mL 离心管内。重复提取一次，合并两次提取液。加正己烷20mL， 涡旋混匀， 3000rpm/min 离心 Smin，弃上层正己烷。将上清液转移至另一 50mL 离心管内。用 10mol/LNaOH溶液调 pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15mL， 涡旋混匀，并振荡 10min， 5000rpm 离心 5min，取出上层有机相至另一50mL离心管内。再在下层水相中加入叔丁基甲醚10mL， 涡旋混匀，并振荡10min， 5000rpm离心 5min， 合并有机相，50℃下氮气吹干，用2%甲酸溶液5mL溶解，备用。 MAX固相萃取柱依次用甲醇、水、2%甲酸溶液各3mL 活化，取备用液全部过柱，再依次用2%甲酸溶液、甲醇各3mL淋洗，抽干，用3%氨水甲醇溶液2.5mL 洗脱：洗脱液在50℃下用氮气吹干。 残余物用甲醇-0.1%甲酸溶液(10+90，V/V) 0.2mL溶解，涡旋混匀， 15000rpm高速离心10min， 取上清液适量，供液相色谱-串联质谱仪测定。 2.2.3测定 2.2.3.1液相色谱条件 色谱柱： XBridgeC；色谱柱， 150mm×2.1，粒径 Sum；流动相：A相：B相，梯度 洗脱程序见表4； A 相：0.02%乙酸乙腈溶液 B相：0.02%乙酸水溶液 柱温：：室温；进样量：20pL。 2.2.3.2质谱条件 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：3000V；'；源温：80℃；雾化温度：300℃；雾化气流速：4450L/h：反吹气流速：25L/h 药物保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表5 表4流动相梯度洗脱条件和流速 Tab.4 Mobile phase gradient elution conditions and the flow rate 时间 (min) 流速(mL/min) A相(%) B相(%) 0 0.30 15 85 8 0.30 90 10 13 0.30 90 10 14 0.30 15 85 20 0.30 15 85 表56种玉米赤醇保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量 Tab.5 6 zearalanol retention time， qualitative and quantitative ion-pair and hole cone voltage，collision energy 药物名称 保留时 定性离子对 定量离子对 锥孔电 碰撞能 间 (m/z) (m/z) 压(V) 量 (eV) (min) a-玉米赤醇 3.16 321>277 321>277 40 20 321>303 40 23 β-玉米赤莓醇 2.56 321>277 321>277 40 20 321>303 40 23 a-玉米赤霉烯 3.31 319>275 319>275 40 20 醇 319>301 40 22 β-玉米赤霉烯 2.64 319>275 319>275 40 20 醇 319>301 40 22 玉米赤霉酮 5.14 319>275 319>275 40 20 319>205 40 20 玉米赤霉烯酮 5.32 317>273 317>273 40 18 317>175 40 18 2.2.3.3测定 取试料溶液和空白添加标准溶液，作单点校准，外标法计算。 2.2.4结果 2.2.4.16种玉米赤霉醇标准物质色图谱 6种玉米赤霉醇标准物质色谱图见图9。从图9可看出6种玉米赤霉醇的出峰时间依次为3.153、2.559、3.301、2.627、5.154和 5.335min。 图96种玉米赤霉醇标准物质色谱图 Fig.9 Six kinds of standard zearalanol material chromatogram 2.2.4.26种玉米赤霉醇准准物质质图谱 6种玉米赤霉醇标准物质质谱图见图10-15。a列为出峰时间：对应图9的色谱图；b列为两种子离子碎片比例；c列为碎片离子峰图，在相应的保留时间段中，代表这种物质荷质比的母离子与两种子离子碎片响应值符合定性与定量离子对条件。 Target Compound1a-Zearnol(a-玉米赤霉醇) TargetCompoundb-Zearnol(β-玉米赤霉醇) Target Compound a-zearalenol(a-玉米赤霉烯醇) Target Compound b-zearalenol(β-玉米赤霉烯醇) Target CompoundZEA (玉米赤霉酮) Target CompoundZearalenone(玉米赤霉烯酮) a b 图10-156种玉米赤霉醇标准物质质谱图 Fig.10-15 6 zearalanol mass spectrum of standard material Counts：响应值 Acquisition Time：保留时间 Relative Abundance：碎片离子比例 Mass -to-Charge：质合比 2.2.4.3前处理过程的优化 2.4.4.3.1牛奶中蛋白质的去除 牛奶中含大量蛋白质及少量脂肪，采取加入18%硫酸溶液 0.1mL 和正己烷 10mL，高速离心去除 2.4.4.3.2提取液与缓冲液的选择 常用于提取糖皮质激素的溶剂包括甲醇、：二氯甲烷、乙腈等，从溶剂的毒性和价格考虑，本文最终选取乙腈作为提取液。 2.4.4.3.3 pH 的调节 乙腈提取时需要碱性环境， 用 5mol/LNaOH 溶液将 pH调成 11 2.4.4.3.4固相萃取柱的选择 玉米赤霉醇的浓缩与净化可通过固相萃取来完成，一般采取联合使用，即反相固相萃取柱如 HLB、C18、C8等进行浓缩，正相固相萃取柱如氨基柱、氧化铝柱、硅胶柱等进行净化。本文从多方面考虑，最终使用氮气吹干方法进行提取液夜浓缩，虽然在吹干过程中可能使玉米赤霉醇有一定损失，但在后面的空白添加实验回收率证明此损失在忽略范围内，这样可大大节约成本，较适合在一般检测机构应用。选取 MAX 固相萃取柱进行净化。 2.2.4.4色谱条件的优化 2.4.4.4.1色谱柱的选择 Cg柱是目前玉米赤每醇检测常用的液相色谱柱，本文采用了 XBridgeC色谱柱，规格为150mm×2.1，粒径5um。 2.4.4.4.2流动相的选取 本文通过一系列预实验，得出在甲酸含量为0.02%时，玉米赤赤醇的响应值最高，所以采用了乙腈+0.02%甲酸为流动相。 2.2.4.5方法检出限 将不同浓度的β-受体激动剂标准溶液添加到空白样品中，配制成浓度较低的一组样品，按照样品前处理步骤每种浓度重复10次，进行3次单独试验。以30次测定结果的信噪比均大于10的最小浓度为定量限。以30次测定结果的信噪比均大于3的最小浓度为检测限。 a-玉米赤霉醇、、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤长烯酮检出限为0.5ug/kg、定量限为 1.0u g/kg. 2.2.4.6空白试料添加标液回收率 选取空白试料添加各浓度玉米赤霉醇标液，使空白试料最终含各玉米赤霉霉浓度为2.0u g/kg， 按前处理方法提取、净化后上机测定，重复10次进行实验，外标法计算回收率和相对标准偏差，结果见表6，可以看出，醇的回收率范围在84.5-103.7%， RSD范围在2.8-4.7%。 表6玉米赤霉醇空白试料添加标液回收率 Tab.6 Zearalanol add blank sample standard liquid recovery 玉米赤醇 最终浓度(ug/kg) 回收率(%) RSD(%) a-玉米赤霉醇 2 86.9 3.4 β-玉米赤霉醇 2 95. 4.7 a-玉米赤霉烯醇 2 103.7 2.8 β-玉米赤霉烯醇 2 84.5 4.1 玉米赤霉酮 2 92.3 3.6 玉米赤霉烯酮 2 92.4 3.7 2.2.5样品检测 利用本方法对抽检56个奥运动物源性食品进行检测，用保留时间和检出峰的光谱图进行定性分析，均未检出玉米赤霉醇。代表样品分离色谱图如图16。由图16可知：在6种玉米赤霉醇出峰时间范围内无可疑峰出现，证明样品中不含玉米赤霉醇。 图16样品分离色谱图 Fig.16 Samples separation chromatogram 2.3 速冻调制食品中糖皮质激素残留检验 2.3.1仪器与试剂 液相色谱-串联质谱仪：Agilent 1200-6410；色谱柱： 20RBAX SB-C18；分析天平： BS200S；冷冻高速离心机： CT-RT15；氮吹仪： N-EVAP112：固相萃取装置。 甲醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸、氢氧化钠均为分析纯，氢氧化钠配制为0.1mol/L溶液备用；乙晴为色谱纯；糖皮质激素类药物标准品包括泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松乙酸盐、倍氯米松、氢化可的松纯度大于等于 99%，用甲醇溶解，配制成1000 p g/mL 的单标储备液，一-20℃保存。 2.3.2样品处理 准确确取 2g组织试料于 50mL 离心管中，加乙酸乙酯15mL，漩涡混匀， 15000r/min离心 15min 移取乙酸乙酯层。于于渣中加入 0.1mol/L 氢氧化钠溶液10mL， 混匀，加乙酸乙酯20mL， 漩涡混合， 200r/min 床振动 15min， 8000r/min 离心15min， 移取乙酸乙酯层。合并两次提取液，40℃氮吹至近干，加乙酸乙酯 1mL 和正己烷5mL， 溶解残渣。 用正己烷6mL 活化 Silica 固相萃取柱，提取液过柱，用正己烷 6mL淋洗萃取柱，抽干，用正正烷-丙酮(6/4，， V/V) 6mL洗脱。洗脱液50℃司气吹干，加20%乙腈水溶液0.5mL， 溶解残渣，转入 1.5mL离心管中， 15000r/min 离心 20min，取上清液，过0.22m滤膜， 上机测定。 2.3.3测定 2.3.3.1液相色谱条件 色谱柱： 20RBAX SB-C18色谱柱， 150mm×2.1mm，粒径3.5pm；流动相：A相：B相，梯度洗脱程序见表7； A相：0.1%甲酸水溶液B相：：乙腈；柱温：40℃；进样量：20L。 2.3.3.2质谱条件 离子源：：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：选择反应监测；喷雾电压：4000V；离子传输管温度：330℃；鞘气压力： 400arb；辅助气压力：6arb； 糖皮质激素类药物选择反应监测的优化参数见表8 表7流动相梯度洗脱条件和流速 Tab.7 Mobile phase gradient elution conditions and the flow rate 时间(min) 流速(mL/min) A相(%) B相(%) 0 0.30 75 25 9 0.30 65 35 15 0.30 65 35 15.1 0.30 10 90 17 0.30 10 90 表8糖皮质激素类药物选择反应监测的优化参数 Tab.8Glucocorticoid drugs to choose the optimal reaction monitoring parameters 药物名称 英文名称 相对保留时 定性离子对寸5定量离子对 Tube 间(min) lens/V 倍氯米松 Beclomethaso 12.9 410.0>374.0 410.0>374.0 13 ne 410.0>392.0 13 倍他米松 Betamethason 11.1 393.0>355.0 393.0>355.0 15 e 393.0>373.0 10 地塞米松 Dexamethaso 11.5 393.0>355.0 393.0>355.0 15 ne 393.0>373.0 10 氟氢可的 Fludrocortiso 15.8 423.0>325.0 423.0>325.0 13 松乙酸盐 ne Ace 423.0>239.0 26 氢化可的 Hydrocortiso 7.8 363.1>327.1 363.1>327.1 16 松 ne 363.1>121.1 11 泼尼松龙 Prednisolone 7.8 361.1>147.2 361.1>147.2 22 361.1>343.0 27 泼尼松 Prednisone 7.9 359.0>147.0 359.0>147.0 20 359.0>341.3 11 2. 3.4结果 2.3.4.1 糖皮质激素标准物质色谱图 糖皮质激素标准物质色谱图见图17。从图17可看出7种糖皮质激素的出峰时间依次为12.935、11.121、11.497、15.768、7.815、7.776和7.887min。 图17糖皮质激素色谱图 Fig.17 glucocorticoid chromatogram 2.3.4.2糖皮质激素标准物质质谱图 糖皮质激素标准物质质谱图见图 18-24。a列为出峰时间：对应图17色谱图；b列为两种子离子碎片比例； c列为碎片离子峰图，在相应的保留时间段中，代表这种物质荷质比的母离子与两种子离子碎片响应值符合定性与定量离子对条件。 TargetCompoundBeclomethasone(倍氯米松) Target Compound Betamethason(倍他米松) + MRM (393.0→373.0) bl8o-25-2.d 9x10 ：Betamethasone8 7 65·3-2-1-im0- 11 11.1 Target Compound Dexamethasone(地塞米松) Target Compound Fludrocortisone Ace(氟氢可的松乙酸盐) Target Compound Hydrocortisone(氢化可的松) Target Compound Prednisolone(泼尼松龙) +MRM(361.1>343.0) blao-25-2.d 361.1>343.0，361.1→147.2 +MRM：7 (7.580-7.995 min， 54 scans) (36.. 图18-24糖皮质激素标准物质质谱图Fig.18-24 Glucocorticoid mass spectrum of standard material Counts：响应值 Acquisition Time：保留时间 Relative Abundance：碎片离子比例 Mass -to-Charge：质合比 2.3.4.3前处理过程的优化 2.3.4.3.1高速冷冻离心 本文是将速冻调制肉制品作为试验对象，，它在加工过程中，被人为添加大量淀粉、调料等物质，所以在前处理过程中，除了去除脂肪、蛋白质等杂质外，还需将淀粉类物质去除。本文采取高速冷冻离心方法，将8000rpm10分钟提高为 15000rpm15分钟， 经过对比后者提取液明显更加清澈、透明，证明淀粉去除效果良好。 2.3.4.3.2提取液与缓冲液的选择 常用于提取糖皮质激素的溶剂包括甲醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯等，从溶剂的毒性和价格考虑，本文最终选取乙酸乙酯作为提取液。 样品中的脂肪通过正己烷以液液萃取方式去除；蛋白质通过加入缓冲液去除，本文选取的缓冲液为 0.1mol/L 氢氧化钠溶液。 2.3.4.3.3固相萃取柱的选择 糖皮质激素的浓缩与净化可通过固相萃取来完成，一般采取联合使用，即反相固相萃取柱如 HLB、C18、C8等进行浓缩，正相固相萃取柱如氨基柱、氧化铝柱、硅胶柱等进行净化。本文从多方面考虑，最终使用氮气吹干方法进行提取液的浓缩，虽然在吹干过程中可能使糖皮质激素有一定损失，但在后面的空白添加实验回收率证明此损失在忽略范围内，这样可大大节约成本，较适合在一般检测机构应用。选取 Silica 硅胶固相萃取柱进行净化。 2.3.4.4色谱条件的优化 2.3.4.4.1色谱柱的选择 C18 柱是目前糖皮质激素检测常用的液相色谱柱，本文采用了 20RBAX SB-C8柱，规格为150mm×2.1mm， 粒径3.5um。 2.3.4.4.2柱温的选择 糖皮质激素在45℃以上会发生分解，温度太低，出峰慢，因此选取柱温为45℃。 2.3.4.4.3流动相的选取 O. Van den hauwel60]研究糖皮质激素残留时采用了乙腈/水(90/10，v/v) +0.3%甲酸作为流动相。本文通过一系列预实验，得出在甲酸含量为0.1%时，糖皮质激素的响应值最高，所以采用了乙腈+0.1%甲酸为流动相。 2.3.4.5方法检出限 将不同浓度的糖皮质激素类药物的标准溶液添加到空白样品中，配制成浓度较低的一组样品，按照样品前处理步骤每种浓度重复10次，进行3次单独试验。以30次测定结果的信噪比均大于10的最小浓度为定量限。以30次测定结果的信噪比均大于3的最小浓度为检测限。 泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松的检出限为 0.2 ug/kg、定量限为 0.5ug/kg；倍氯米松和氟氢可的松的检出限为0.5 ug/kg、的定量定为 1.0 ug/kg；氢化可的松的检出限为1.0ug/kg、定量限为 2.0ug/kg。 2.3.4.6空白试料添加标液回收率 选取空白试料添加各浓度糖皮质激素标液，使空白试料最终含各糖皮质激素浓度为2.0u g/kg， 按前处理方法提取、净化后上机测定，重复10次进行实验，外标法计算回收率和相对标准偏差，结果见表9，可见7种糖皮质激素的回收率范围在 85.0-96.4%，RSD 范围在2.3-6.1%。 表9空白试料添加标液回收率 Tab.9 Add a blank sample standard liquid recovery 糖皮质激素 最终浓度(pg/kg) 回收率(%) RSD(%) 倍氯米松 2.0 87.3 2.3 倍他米松 2.0 89.0 3.4 地塞米松 2.0 85.4 4.1 氟氢可的松乙酸盐 2.0 90.3 2.7 氢化可的松 2.0 85.0 6.1 泼尼松龙 2.0 96.4 5.3 泼尼松 2.0 87.8 2.5 2.3.5样品检测 利用本方法对抽检56个奥运动物源性食品进行检测，用保留时间和检出峰的光谱图进行定性分析，均未检出糖皮质激素。代表样品分离色谱图如图25。由图25可知：在7种糖皮质激素出峰时间范围内无可疑峰出现，证明样品中不含糖皮质激素。 图25样品分离色谱图 Fig.25 Samples separation chromatogram 2.4鸡蛋中类固醇类激素残留检验 2.4.1仪器与试剂 液相色谱-串联质谱仪： Agilent 1200-6410；色谱柱：20RBAXSB-C18；分析天平：BS200S；冷冻高速离心机： CT-RT15；氮吹仪： N-EVAP112：固相萃取装置。 甲酸、碳酸钠均为分析纯，碳酸钠配制为10%溶液备用；乙腈、甲醇和叔丁基甲醚为色谱纯；类固醇类激素类药物标准品包括美雄酮、甲基睾酮、黄体酮、睾酮、丙酸睾酮、群勃龙纯度大于等于98%，用甲醇溶解，配制成100u g/mL 的单标储备液，-20℃保存。 2.4.2样品处理 准确角取5g 组织试料于 50mL 离心管中，加碳酸钠溶液 3mL 和叔丁基甲醚 25mL，漩涡混匀，振荡10min， 4℃6000r/min 离心 10min 移取上清液，重复提取一次，合并上清液。40℃水浴旋转蒸干。用乙腈水溶液(50%)2mL溶解残渣，漩涡混匀，冷冻 30min，16000r/min 离心5分钟，取适量上清液，过 0.22m滤膜，上机测定。 2.4.3测定 2.4.3.1液相色谱条件 色谱柱： 20RBAXSB-Cj8色谱柱， 150mm×2.1mm， 粒径1.7um； 流动相： A相：B 相，梯度洗脱程序见表10： A相：0.1%甲酸水溶液B相：乙腈；柱温：30℃；进样量：：10uL. 2.4.3.2质谱条件 离子源：：1电喷雾离子源；扫描方式：：正离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压：3000V；离子传输管温度：430℃； 类固醇类激素选择反应监测的优化参数见表11 表10流动相梯度洗脱条件和流速 Tab.10 Mobile phase gradient elution conditions and the flow rate 时间(min) 流速(mL/min) A相(%) B相(%) 0 0.30 50 50 5 0.30 10 90 7 0.30 10 90 7.5 0.30 50 50 10 0.30 50 50 表11类固醇类激素选择反应监测的优化参数 Tab.11 Steroid hormone select the optimal reaction monitoring parameters 药物名称 英文名称 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 Tube (V) lens/v 美雄酮 Methandieno 301.7>121.4 301.7>121.4 25 25 ne 301.7>283.6 10 甲基睾酮 Methyltestost 303.5>97.3 303.5>109.4 30 25 erone 303.5>109.4 25 黄体酮 Progesterone 315.5>97.5 315.5>97.5 37 20 315.5>109.3 23 睾酮 Testosaterone 289.5>97.3 289.5>97.3 35 25 289.5>109.1 30 丙酸睾酮 Testosterone 345.7>97.3 345.7>109.3 30 20 Propionate 345.7>109.3 22 群勃龙 Trenbolone 271.5>199.4 271.5>199.4 45 20 271.5>253.5 20 2.4.4结果 2.4.4.16种类固醇类激素标准物质色谱图 6种类固醇类激素标准物质色谱图见图26。从图26可看出6种类固醇类激素的出峰时间依次为3.292、3.728、6.407、3.076、9.316和2.459min。 图266种类固醇类激素标准物质色谱图 Fig.26 Steroid hormone select the optimal reaction monitoring parameters 2.4.4.26类固醇类激素标准物质质谱图 6种类固醇类激素标准物质质谱图见图27-32。a列为出峰时间：对应图26色谱图；b列为两种子离子碎片比例；c列为碎片离子峰图，在相应的保留时间段中，代表这种物质荷质比的母离子与两种子离子碎片响应值符合定性与定量离子对条件。 Target Compound Methandienone(美雄酮) Target Compound Methyltestosterone(甲基睾酮) Target Compound Progesterone (黄体酮) Target Compound Testosaterone(睾酮) Target Compound Testosterone Propionate(丙酸睾酮) Target Compound Trenbolone (群勃龙) 图27-326种类固醇类激素标准物质质谱图 Fig.27-326 types of steroid hormones mass spectrum of standard material Counts：响应值 Acquisition Time：保留时间 Relative Abundance：碎片离子比例 Mass -to-Charge：质合比 2.4.4.3前处理过程的优化 2.4.4.3.11高速冷冻离心 鸡蛋蛋清中含大量蛋白质，所以要通过高速冷冻离心去除蛋白质和少量的脂肪，在实验中通过加大转速和时间，采取 10000r/min 离心15分钟取得最佳效果。 2.4.4.3.2提取液与缓冲液的选择 常用于提取类固醇类激素的溶剂包括甲醇、乙腈、叔丁基甲醚等，从溶剂的毒性和价格考虑，本文最终选取叔丁基甲醚作为提取液。 2.4.4.3.3碱性环境的实现 类固醇类激素在被叔丁基甲醚提取时需要碱性环境，本文通过10%碳酸钠溶液实现。 2.4.4.4色谱条件的优化 2.4.4.4.1色谱柱的选择 C18 柱是目前类固醇类激素检测常用的液相色谱柱，本文采用了 20RBAX SB-C柱，规格为150mm×2.1mm，粒径1.7ym。 2.4.4.4.2柱温的选择 类固醇类激素在30℃以上会发生分解，温度太低，出峰慢，因此选取柱温为45℃。 2.4.4.4.3流动相的选取 本文通过一系列预实验，得出在甲酸含量为0.1%时，类固醇类激素的响应值最高，所以采用了乙腈+0.1%甲酸为流动相。 2.4.4.5方法检出限 将不同浓度的类固醇类激素类药物的标准溶液添加到空白样品中，配制成浓度较低的一组样品，按照样品前处理步骤每种浓度重复10次， 进行3次单独试验。以30次测定结果的信噪比均大于10的最小浓度为定量限。以30次测定结果的信言比均大于3的最小浓度为检测限。 美雄酮、甲基睾酮和睾酮的检出的为 0.3 ug/kg、定量限为 1.0u g/kg；活脱脱、丙酸睾酮和群勃龙的检出限为 0.4ug/kg、的定量限为 1.0u g/kg. 2.4.4.6空白试料添加标液回收率 选取空白试料添加各浓度类固醇类激素标液，使空白试料最终含各类固醇类激素浓度为 2.0ug/kg， 按前处理方法提取、净化后上机测定，重复10次进行实验，外标法计算回收率和相对标准偏差，结果见表12，可见6种类固醇类激素的回收率范围在89.1-102.5%， RSD 范围在2.4-5.1%。 表12空白试料添加标液回收率 Tab.12 Add a blank sample standard liquid recovery 类固醇类激素 最终浓度(ug/kg) 回收率(%) RSD(%) 美雄酮 2.0 92.3 3.3 甲基睾酮 2.0 89.4 4.2 黄体酮 2.0 102.5 3.1 睾酮 2.0 96.3 2.4 丙酸睾酮 2.0 89.1 5.1 群勃龙 2.0 97.6 3.8 2.4.5样品检测 利用本方法对抽检56个奥运动物源性食品进行检测，用保留时间和检出峰的光谱图进行定性分析，均未检出类固醇类激素。代表样品分离色谱图如图33。由图33可知： 在6种类固醇类激素出峰时间范围内无可疑峰出现，证明样品中不含类固醇类激素。 图33样品分离色谱图 Fig.33 Samples separation chromatogram 2.5 小结 本方法建立了液相色谱-串联质谱检测动物源性食品中四类兴奋剂(25种)残留的方法，其中速冻调制肉制品与常规生鲜肉制品相比状态上有所不同，且在加工过程中可能人为添加了大量脂肪、淀粉等物质，所以本方法在常规除脂肪和蛋白质的基础上采取高速冷冻离心方法去除淀粉等，最大程度的消除基质对目标化合物的影响，并优化了各种色谱条件，以加标回收率和相对标准偏差检验了方法的准确性和精密度，结果如下： 1建立了生鲜肉中6种β-受体激动剂(特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗和喷布特罗)液相色谱-串联质普检测方法，优化了前处理过程，以加标回收率和相对标准偏差检验了方法的准确性和精密度，加标回收实验结果表明，检出限为0.25Hg/kg， 方法回收率在75.4-102.8%之间， RSD 介于 2.4-5.8%之间； 2建立了牛奶中6种玉米赤霉醇(a-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮)液相色谱-串联质谱检测方法，优化了前处理过程，优化了色谱质谱条件，加标回收实验结果表明，检出限为 0.5ug/kg，方法回收率在 84.5-103.7%之间， RSD 介于2.8-4.7%之间； 3建立了速冻调制食品中7种糖皮质激素类(泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松乙酸盐、倍氯米松、氢化可的松)液相色谱-串联质谱检测方法，优 化了前处理过程，确定了提取液和固相萃取柱，以加标回收率和相对标准偏差检验了方法的准确性和精密度，加标回收实验结果表明，检出限为 0.2ug/kg，0.5 u g/kg，1.0u g/kg，方法回收率在85.0-96.4%之间， RSD 介介2.3-4.1%之间； 4建立了鸡蛋中6种类固醇类激素(美雄酮、甲基基酮、黄体酮、睾酮、丙酸睾酮、群勃龙)液相色谱-串联质谱检测方法，优化了前处理过程，优化了色谱质谱条件，加标回收实验结果表明，检出限为 0.3 ug/kg， 0.4u g/kg， 方法回收率在89.1-102.5%之间，RSD 介于 2.4-5.1%之间. 第三章液相色谱-串联质谱在乳及乳制品中三聚氰胺检测上的应用 2008年9月爆发了三聚氰胺重大安全事件，由于之前无相关的乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法，我所在食品院科研人员查文献、找方法、摸条件等，最终建立了三聚氰胺在乳及乳制品中液相色谱-串联质谱的检测方法。 三聚氰胺(英文名： Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，俗{称蜜胺、蛋白精，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、11，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。结构式见图34 图34三聚氰胺结构式 Fig.34 Melamine-structured 三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，无味，密度 1.573g/cm3(16℃)。常压压点354℃(分解)；快速加热升华，升华温度300℃。在水中溶解度随温度升高而增大，在20℃时，约为 3.3 g/L， 即微溶于冷水，溶于热水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。 呈弱碱性(pKb=8)，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性中(pH值5.5~6.5)与羟甲基的衍生物进行缩反反应而生成树脂产物。遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生 成三聚氰酸一酰胺，，最后生成三聚氰酸. 三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。该树脂硬度比脲醛树脂高，不易燃，耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀、有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。 由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法分子用作食品添加剂，以提高食品检测中的蛋白质含量，因此三聚氰胺也被称为“蛋白精” 三聚氰胺进入人体后，发生取代反应(水解)，生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的网状结构，造成结石。美国食品药品管理局(FDA)食品安全高官史蒂芬·桑德洛夫表示，研究发现，在食品中只有同时含有三聚氰胺和三聚氰酸这两种化学成分时才对婴儿健康构成威胁。这看来虽然三聚氰胺和三聚氰酸共同作用下才会导致肾结石，但是三聚氰胺在胃的强酸性环境中会有部分水解成为三聚氰酸，，因此只要含有了三聚氰胺就相当于含有了三聚氰酸，其危害的本身仍源于三聚氰胺。 目前测定三聚氰胺的检测方法包括气相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)， 并且都集中在饲料或宠物食品中。它们存在过程繁琐、检出限高、特异性差的缺点，因此本文研究了乳及乳制品中三聚氰胺的液相色谱-串联质谱检测方法。 3.1材料与方法 3.1.1仪器与试剂 液相色谱-串联质谱仪： Agilent 1200-6410；色谱柱： Hyperisl Sio硅胶色谱柱：分析天平： BS200S；冷冻高速离心机： CT-RT15；氮吹仪： N-EVAP112；固相萃取装置。 盐酸、甲酸铵均为优级纯，乙腈、甲醇为色谱纯，甲酸铵配制为 0.02mol/L (pH=5)溶液备用，氨水甲醇溶液：5mL氨水溶解至100mL甲醇中；三聚氰胺标准物质纯度大于等于99%，称取100mg三聚氰胺标准物质用乙腈水溶液(7：3)溶解至100mL 容量瓶中，配制成 1000 p g/mL 的储备液。 3.1.2样品处理 奶粉样品称取 2g于 50mL 具塞刻度离心管中，分别加入25mL乙腈： 水(60：40)混合提取液和 1mL1mol/L 盐酸水溶液，提取液定容至刻度，超声提取 20min， 10000r/min低温离心5min， 上清液待净化。 液态乳样品称取 10g于 50mL 具塞刻度离心管中，分别加入25mL 乙腈提取液和1mL1mol/L 盐酸水溶液，提取液定容至刻度，超声提取20min，10000r/min 低温离心 5min，上清液待净化。 酸奶样品称取 10g于 50mL 具塞刻度离心管中，分别加入25mL乙腈：水(80：20)混合提取液和 1mL1mol/L 盐酸水溶液，提取液定容至刻度，超声提取 20min， 10000r/min低温离心 Smin， 上清液待净化。 依次加入 3mL甲醇、3mL水活化固相萃取柱，准确移取 10.0mL上清液过固相萃取柱，控制过柱速度在 1mL/min 以内。再依次加入3mL水和3mL 甲醇淋洗固相萃取柱，抽近干，用8mL氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于50℃氨气吹干，用20%乙腈水溶液1.0mL 溶解残渣，旋涡混匀 1min， 10000r/min 低温离心 5min， 上清液过 0.221m滤膜，上机测定。 3.1.3测定 3.1.3.11液相色谱条件 色谱柱： Hyperisl SiOz硅胶色谱柱， 250mm×4.6mm粒径1.71m 流动相：A相：B相，梯度洗脱程序见表 13；A相：乙腈水溶液B相：：F甲酸铵；柱温：40℃；进样量：10uL. 3.1.3.2质谱条件 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：选择反应监测；喷雾电压：4000V；干燥气温度：350℃；干燥气流速：12L/min；雾化气压力： 45psi；源内裂解电压：120V；定量离子对：127/85；碰撞电压：20V；定性离子对：127/68；碰撞电压：35V。 表13流动相梯度洗脱条件和流速 Tab.13 Mobile phase gradient elution conditions and the flow rate 时间(min) 流速(mL/min) A相(%) B相(%) 0 0.80 80 20 5 0.80 100 0 6 0.80 100 0 6.1 0.80 80 20 13 0.80 80 20 3.1.3.3测定 取试样溶液和相应的空白添加标准溶液，单点校准，外标法计算 3.2结果 3.2.1三聚氰胺标准物质色谱图 三聚氰胺标准物质色谱图见图35。从图35可看出三聚氰胺的出峰时间为 5.124min。 图35三聚氰胺标准物质色谱图 Fig.35 Standard chromatogram of melamine material 3.2.2三聚氰胺标准物质质谱图 三聚氰胺标准物质质谱图见图 36.a 为两种子离子碎片比例；b列为碎片离子峰图，在相应的保留时间段中，代表这种物质荷质比的母离子与两种子离子碎片响应值符合定性与定量离子对条件。 a b 图36三聚氰胺标准物质质谱图 Fig.36 Standard mass spectrum of melamine material Acquisition Time：保留时间 Relative Abundance：碎片离子比例 Mass -to-Charge：质合比 3.2.3前处理条件的优化 由于试样状态不同，主要是含水量的不同(奶粉、酸奶和液态奶)，在试验过程中，发现单一加乙腈使得奶粉和酸奶在离心过程中不能很好分层，影响了下一步的过柱净化，所以适当调高了乙腈与水的比例(奶粉用6：4；酸奶用8：2；液态奶用乙腈)，结果表明效果良好。 3.2.4 方法检出限 将不同浓度的类固醇类激素类药物的标准溶液添加到空白样品中，配制成浓度较低的一组样品，按照样品前处理步骤每种浓度重复10次，进行3次单独试验。以30次测定结果的信噪比均大于3的最小浓度为检测限。 此方法三聚氰胺在乳及乳制品中的检出限为 0.01mg/kg。 3.2.5空白试料添加回收率 选取3种空白试料添加三聚氰胺标液，使空白试料最终含三聚氰胺浓度为0.1mg/kg，按前处理方法提取、净化后上机测定，重复10次进行实验，外标法计算回收率和相对标准偏差，结果见表14，可见3类样品中三聚氰胺的回收率范围在88.1-95.7%， RSD范围在2.3-3.1%。 表 14空白试料添加标液回收率 Tab.14 Add a blank sample standard liquid recovery 样品 最终浓度(mg/kg) 回收率(%) RSD(%) 奶粉 0.1 95.7 2.3 酸奶 0.1 82.4 3.1 液态奶 0.1 88.1 2.5 3.3小结 本方法建立了液相色谱-串联质谱检测乳及乳制品中三聚氰胺残留的方法，根据样品状态的不同调整了提取液的比例，使用乙腈作为提取液，氨水甲醇作为过柱洗脱液，效果良好，与液相色谱法去气相色谱-质谱联用方法相比，更加灵敏，，以加标回收率和相对标准偏差检验了方法的准确性和精密度，加标回收实验结果表明，方法回收率在82.4-95.7%之间， RSD 介于 2.3-3.1%之间，准确度符合国家对于三聚氰胺残留的检验要求。 第四章结论 本文建立了液相色谱-串联质谱方法检测动物源食品中四类25种兴奋剂及乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法，优化了前处理过程，优化了色谱和质谱条件，以空白试料添加试验的回收率和 RSD 值验证了方法的灵敏性和准确性. 1建立了生鲜肉中6种β-受体激动剂(特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗和喷布特罗)液相色谱-串联质谱检测方法，优化了前处理过程，以加标回收率和相对标准偏差检验了方法的准确性和精密度，加标回收实验结果表明，检出限为 0.25g/kg， 方法回收率在 75.4-102.8%之间， RSD 介于2.4-5.8%之间； 2建立了牛奶中6种玉米赤霉醇(a-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、、a-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮)液相色谱-串联质谱检测方法，优化了前处理过程，优化了色谱质谱条件，加标回收实验结果表明，检出限为0.5 u g/kg，方法回收率在84.5-103.7%之间， RSD 介于2.8-4.7%之间； 3 建立了速冻调制食品中7种糖皮质激素类(泼尼公、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松乙酸盐、倍氯米松、氢化可的松)液相色谱-串联质谱检测方法，优化了前处理过程，确定了提取液和固相萃取柱，以加标回收率和相对标准偏差检验了方法的准确性和精密度，加标回收实验结果表明，检出限为 0.2 ug/kg，0.5u g/kg，1.0u g/kg，方法回收率在 85.0-96.4%之间， RSD 介于 2.3-4.1%之间； 4建立了鸡蛋中6种类固醇类激素(美雄酮、甲基睾酮、黄体酮、睾酮、丙酸睾酮、群勃龙)液相色谱-串联质谱检测方法，优化了前处理过程，优化了色谱质谱条件，加标回收实验结果表明，检出限为 0.3 ug/kg， 0.4 ug/kg， 方法回收率在 89.1-102.5%之间，RSD 介于2.4-5.1%之间. 5建立了液相色谱-串联质谱检测乳及乳制品中三聚氰胺残留的方法，根据样品状态的不同调整了提取液的比例，使用乙腈作为提取液，氨水甲醇作为过柱洗脱液，效果良好，与液相色谱法和气相色谱-质谱联用方法相比，更加灵敏，以加标回收率和相对标准偏差检验了方法的准确性和精密度，加标回收实验结果表明，方法回收率在82.4-95.7%之间， RSD 介于2.3-3.1%之间，准确度符合国家对于三聚氰胺残留的检验验求 第五章讨论 随着人民生活水平的提高，环境保护与食品安全问题已经成为人们日益关注的问题。我国的食品安全形式不容乐观，随着食品中微量检测要求的提高，液相色谱-串联质谱的检测方法在越来越多的方面得到应用。2008年北京奥运会的举办和三聚氰胺重大食品安全事件的发生都在督促我们重视食品安全的检测，建立食品安全预警平台，保护人们的生命安全。 液相色谱-质谱联用技术始于20世纪70年代，并在80年代中后期得到发展并逐渐成熟，并在药物分析、法医学、商检、环境科学、生命科学等领域的广泛应用，尤其是近年来，在食品安全检测方面发挥重大作用，例如动植物源性食品中的兽药、农药残留，食品中的添加剂检测方面等。与传统液相色谱法、气相色谱-质谱联用法相比，液相色谱-串联质谱方法具有过程简便、特异性好、灵敏度高的特点，所以河北省食品质量监督检验研究院新购置了液相色谱-串联质谱仪，以适应奥运会动物源食品兴奋剂批批检验，并在随后的三聚氰胺事件中发挥了重要作用。 本方法建立了液相色谱-串联质谱检测动物源性食品中四类兴奋剂(25种)残留和乳及乳制品中三聚氰胺残留的方法。在实验过程中所遇到的问题如下： 1、不同基质对前处理的影响。在液相色谱检测中基质效应是影响灵敏度的重要因素，本方法采取了选择性更强的液相色谱-质谱/质谱，减轻了一部分基质效应，但样品基质中与待测物质同时洗脱出的杂质对分析物离子化的影响，常常造成待测物质信号被抑制或增强，所以在前处理过程中要进行有效的纯化步骤，最大程度的消除基质效应，其中速冻调制肉制品与常规生鲜肉制品相比状态上有所不同，且在加工过程中可能人为添加了大量脂肪、淀粉等物质，所以本方法在常规除脂肪和蛋白质的基础上采取高速冷冻离心方法去除淀粉等，最大程度的消除基质对目标化合物的影响。 2、纯化过程中固相萃取装置的选择。在初步提取完完后要进行有效的净化步骤，由于我们所面临的样品较多，如何节省时间并保证结果的准确性较重要。双向固相萃取中操作性要求高，并且成本较高，对于检测机构来说不适用，因此本文采取了单一柱净化，并采取氮气吹干方式浓缩，通过空白添加试料试验，回收率和 RSD 值符合要求，证明净化过程中损失不大。 3、内源性激素的识别。在本文所研究的25种兴奋剂中，其中有一些为内源性激素， 即动物体身所产生的激素，在样品检测中，确实有少量样品检出痕量的睾酮、氢化可的松等，经上报国家兴奋剂研究中心最终证明为动物内源性激素，这对于检验机构区别是否人工添加激素，检验报告的判定具有重要意义。 4、样品最终检验结果上。有个别物质色谱分离效果较差，保留时间很接近，不利于更加严谨的定量，而且从糖皮质激素的样品分离图上可看出杂峰很多，证明前处理过程干扰基质处理不彻底，前处理过程还有待优化，这两方面是今后试验需要提高和改进的方面。 本研究工作初步表明，与液相色谱、气相色谱-质谱联用等方法相比，液相色谱-串联质谱结合了液相色谱的高分离性和质谱检测器的高灵敏性，尤其在三聚氰胺的检测中，从各标准中不同方法的检出限来比较，液相色谱法的检出限为 2mg/kg， 只能用于样品的初筛；气相色谱-质谱法检出限为 0.05mg/kg， 但需要衍生化，过程繁琐；液相色谱-串联质谱法检出限为 0.01mg/kg， 既具有高度灵敏性，过程又简单，为最佳方法。所以液相色谱-串联质谱在今后的各个领域的微量检测中应能发挥更大的作用。但液相色谱-串联质谱的缺点是成本较高，在一些经济不发达的地区不能普及，另外谱图解析技术不成熟，这两方面都限制了了的进一步发展和应用。 另有文献报道，国外外研究出专门用于筛选样本中兴奋剂的 ELISA 试剂盒，在定性检测应用方面更加灵敏、迅速[61]。在政府部门如工商、质检系统的现场执法过程中，为了节约时间和成本，也可以使用更加迅速的现场筛选试纸或简单仪器，而我国这方面研究与国外差距较大，应尽快加强此方面研究，确保国内动物源食品安全性，提高我国农副产品在国际市场上的竞争性。 ( 参考文献 ) ( [l] Lehrer M. 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