高效液相色谱在食品添加剂中的应用

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口 岸 卫 生 控 制PORT HEALTH CONTROL第6卷第1期Vol.6 No.1·28· 第6卷第1期Vol.6 No.1高效液相色谱法在食品添加剂检验中的应用·29· 高效液相色谱法在食品添加剂检验中的应用 刘 淳 郑 毅 天津经济技术开发区卫生防病站(300457) 随着我国国民经济的高速发展，食品工业产值已跃居我国国民经济首位。随着食品工业的发展，食品添加剂已成为加工食品不可缺少的基料，改善食品的质量、色香味，对原料至成品的保鲜、保质，对提高食品的营养价值等方面都起着极为重要的作用。 国际上使用的食品添加剂种类到目前为止已达14000 余种，其中直接使用的4000余种，常用的1000余种。世界各国对食品添加剂的定义不尽相同，因此，所规定的种类亦各不相同。中国食品卫生法(1995年)中规定：食品添加剂指“为改善食品品质和色香味以及为防腐或根据加工工艺的需要而加入食品中的化学或天然物质”。 食品添加剂本身不一定具有营养价值，甚至有些对人体还具有一定的毒性，如在食品工艺中无限制的使用，可能引起各种形式的毒理表现，所以检验食品添加剂在各种食品中的含量，成为各种食品添加剂能否保证消费者健康的关键，目前对食品添加剂的检验手段有比色法、气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法等多种方法，本文就高效液相色谱法在食品添加剂的检验中的应用做一简单介绍。 1 营养强化剂 按中国食品卫生法规定，营养强化剂是“指为增强营养成分而加入食品中的天然的或人工合成的属于天然营养素范围的食品添加剂”。所谓“天然营养素”是指维持人体正常功能、生长、发育和劳动所需的各种天然食物中所含的物质。在食品中可能缺乏而实际需要强化的营养素分为：氨基酸及含氮化合物、维生素和矿物质三大类。 1.1 D一泛酸钙 即维生素B，营养增补剂，使用量须在1%(以钙计)以下(日本标准)，奶粉强化时为 10mg/100g，蜂蜜中添加0.02%可防止冬季结晶，能缓冲咖啡因及糖精等的苦味。 将样品切碎、加水、硅酮树脂，经均质、离心过滤后定容至适当体积，过微孔滤膜待测。(HPLC 法测定)。 色谱条件 木：C8柱(4.6mmx110mm) 检测器：紫外检测器，波长：200nm。 流速：2ml/min 柱温：室温 进样量：10pl 流动相：取磷酸4.7ml 移入2L的容量瓶中，用水定容过0.45pm的微孔滤膜。 1.2 L一异亮氨酸21 作为营养强化剂的氨基酸和含氮化合物，主要是八种必须氨基酸和牛磺酸。L一异亮氨酸属于必须氨基酸，为婴儿正常发育及成人的氮平衡所必须，存在四种异构体，仅L一型有生理功效，但过量食用将与亮氨酸产生拮抗作用，可强化各种食品如小麦粉、麦谷蛋白等。 由于食品中含微量天然游离的L一异亮氨酸，所以 HPL.C法测得的定量值是食品本身游离的L一异亮氨酸与添加的L一异亮氨酸的合计值。 色谱条件(附氨基酸分析计的 HPLC) 填充剂：凝胶型强酸性阳离子交换树脂，平均粒径 17pm交连联度8%。 柱及柱温：内径9mm长度 50cm55℃ 流动相：柠檬酸缓冲溶液(pH：4.5)0.6ml/min波长：570nm 反应螺旋管：内径0.5mm 长度 20mm 反应槽温度：98℃ (水合)茚满三酮液的流速：0.3ml/min 2 防腐杀虫剂 防腐杀虫剂是一类以保持食品原有性质和营养价值为目的的食品添加剂，视其作用不同，分为防腐剂、抗微生物剂、防霉剂、杀虫熏蒸剂和保鲜剂。 2.1 附腐剂：一般分为酸性防腐剂、酯型防腐剂、无机防腐剂和生物防腐剂四类。 苯甲酸、山梨酸3属酸性防腐剂，主要用于碳酸饮料和果汁中，样品前处理以稀释定容为主(HPLC法测定) 流动相：甲醇+0.02mol/L乙酸铵溶液(5+95) 色谱普：YWG-G一g4.6mmx250mm、10pm不锈钢柱。 流速：1ml/min 进样量：10pl 检测器：紫外检测器230mm 以保留时间定性，峰面积法定量。允许误差：相对误差≤10% 2.2 防霉剂：主要指保持各种食品的新鲜度(不至霉变)而采用的食品添加剂。 2.2.1 纳他霉素14]：主要用于沙拉酱、干酪的防霉。 以沙拉酱样品为例：以减量法称取试样1g左右，置于 10ml具塞比色管中，准确加5ml冰乙酸+水(5+40)将试样充分混匀，剧烈振摇1—2min以1500—2000r/ min 离心 5 min 清液经0.45um 微孔滤膜过滤后待用，以 2mol/L的 NaOH溶液调 pH：6-7之间。 色谱条件 流动相：甲醇+水+冰乙酸(60+40+5) 柱：Cg(4.6mm×150mm)大连依利特科学仪器有限公司。 流速：1ml/min 检测器：紫外检测器，波长：305nm 进样量：10pl 以Rt定性，峰面积定量。 本方法：RSD=2.4%。 2.2.2 水果中 TBZ、OPP 、DP的残留量研究15 样品前处理：称取经匀浆后的样品10.0g，加无水硫酸钠 10g研匀，放人250ml具塞三角瓶中，分别用30、20、20ml乙酸乙酯提取三次，每次振摇2min 合并提取液过滤40℃减压蒸馏至近干，残渣用甲醇溶液定容至5ml，经 0.45um 的滤膜过滤后待测，紫外检测器检测 DP，同时荧光检测器检测 TBZ与 OPP。 色谱条件 流动相：甲醇+0.05mol/L 氨水(60+40) 柱：Ci8不锈钢柱(3.9mmx150mm)。 柱温：35℃ 流速：1.6ml/min 荧光检测器：EX=300nm，Em=360nm ATT：64、GAIN：×100、FILTER：1.5s 以Rt定性，峰面积定量。 三种防霉剂回收率均在91.7%-99.7%、RSD均在1.0%一2.6%。 3 抗氧化剂 抗氧化剂指防止食品成分因氧化而导致变质的一类添加剂，主要应用于防止油脂及富脂食品的氧化酸败，而导致食品的色变及营养成分的破坏。 3.1 异抗坏血酸和异抗坏血酸钠2：主要用于果蔬、鱼、肉、奶油等食品中 流质及半流质食品处理：取取试20g以下，置于100ml棕色容量瓶中，以2%偏磷酸稀释至刻度，经0.45pm滤膜过滤待用。 粉末及固体食品处理：以2%的偏磷酸制成悬浊液，用超声波提取 15min 用 NO.5c 滤纸过滤后，洗涤残渣经0.45pm滤膜过滤后待用。 色谱条件 填充剂：化学键合硅胶(4.6mm×250mm)。 柱温：50℃ 流动相：乙乙+水+醋酸(83+15+2) 流速：3ml/min 检测器：紫外检测器，波长254nm 3.2 L一半胱氨酸盐酸盐 食品中的L一半胱氨酸盐酸盐分解成为半胱氨酸后，用 HPLC 法定量，必要时乘以分子量比即求出L一半胱氨酸盐酸盐含量。 取试样溶液 4ml，在冰水中加冷却过的甲酸溶液、臭氢酸，置于40℃水上减压浓缩至不产生溴，以柠檬酸缓冲液定容至 100ml(pH2.2)待测。 色谱条件 填充：硅胶型强酸性阳离子交换树脂，平均粒度 17pm交联度8%。 柱及柱温：内径9mm 长 50cm55℃ 流动相：柠檬酸缓冲溶液(pH3.25)0.6ml/min 检测波长：570nm 反应圈：内径0.5mm 长 20mm 反应槽温度：98℃ (水合)茚三酮溶液流速：0.3ml/min 注入量：500pl 3.3 九种抗氧化剂的检测16. 九种抗氧化剂是：是食子酸丙酯(PG)、2、4、5一一三羟基苯丁酮(THBP)、叔丁基对苯二酚(TB-HQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、二叔丁基羟甲基苯酚(Ionox-100)、没食子酸辛酯(OG)、丁基化羟基甲苯(BHT)、没食子酸十二酯(DG)，此9种抗氧化剂均稍有毒性，世界各国对其能否用于油脂作食品添加剂的规定不同，针对这种现象建立的同时测定9种抗氧化剂的简便方 法，以适应进出口油脂检验的需求。 样品处理：以乙腈提取，经浓缩定容。 色谱条件 柱温：40℃，检测波长：280nm，进样量：20ul。 梯度洗脱：0--5min，流动相A为30%。5一20min，流动相A从30%线性增至80%。20一30min，流动相A为80%。 仪器：岛津LC- 10A 高效液相色谱仪、SPD-10A紫外检测器。 色谱柱： Lichrosorb RP - 18 (5pm，4.6mmid×250mm)。 流动相：A：1.5%醋酸甲醇溶液；B：1.5%醋酸水溶液。 检出限：1mg/L。 回收率：83.0%-97.7%。 4 增稠剂、稳定剂、胶化剂 这是一类用于改善和稳定流质食品物理性能和组织结构的添加剂。 藻酸钠和藻酸丙二醇酯2。 主要用于调味品、蜜饯、糖霜、布丁、硬糖。有增稠、稳定、固化作用。食品中的藻酸钠和藻酸丙二醇酯是用酵素分解除去蛋白质及果胶后加入硫酸铜，形成藻酸铜沉淀，分离出上清液中残留的藻酸丙二醇，将藻酸铜沉淀溶于氨水为试样溶液。藻酸丙二醇酯以上清液为试样溶液，利用萘酚间苯二醇显色，进行 HPLC定量分析。 色谱条件 柱：化学键合硅胶(C g)4.6mmx250mm。 流动相：乙腈+水+醋酸丁酯(75+20+5)。 流速：1.2ml/min。 检测波长：565mm。 检出限：0.01g/kg。 5 着色剂 亦称食用色素，是使食品染色后提高商品价值的一类呈色物质。分人工合成色素与天然色素两大类，合成色素特点为色泽鲜艳、着色力强、不易褪色用量低、性能稳定，但因其主要为苯胺类色素，在人体内可形成致癌物质。天然色素优点是安全性高、资源丰富，但稳定性差、着色力低、成本高。 5.1 21种合成色素的测定7 (我国准许使用的9种与不准使用的12种)经前处理后的样品溶液，用醋酸调至 pH3.5--4.0然后过 Sep-pak Vac C8柱，水洗后先用50%甲醇将苋菜红、红40、胭脂红、酸性坚牢红、坚牢红、偶氮玉红、 柠檬黄、日落黄、喹啉黄、亮蓝、靛蓝、坚牢绿、羊毛绿和亮黑，全部溶出，酸性红、橙黄Ⅱ、天青蓝、专利蓝可溶出50%，50%甲醇溶出液为 HPLC试验溶液A。 Sep- pak Vac Cj8柱中残留的三种氧杂蒽系色素(赤红、皮皮红、蕊香红)和一部分酸性红、橙黄Ⅱ专利蓝、天青蓝用甲醇溶出，甲醇溶出溶液为 HPLC试验溶液B。 色谱条件 柱：COSMOSIL 5C8-AR(4.6mm×250mm)。 流动相：检测A液为：0.025mol/L乙酸铵溶液(含0.01 mol/L溴化四丁基铵TBA-Br))+乙腈+甲醇(62+28+10)；检测B液为 0.025mol/L乙酸铵(含0.01mol/LTBA -Br)+乙腈+甲醇(50+40+10)。 检测波长：除三种氧杂蒽系色素为 530nm，其他红色素为520nm 黄色素 420nm蓝绿绿色素为620nm. 流速：Iml/min柱温：40℃ 进样量：10pl 在清凉饮料、果冻、糖果中添加各种色素10pg/g回收率分别为85一103%，76—99%和73一103%淹制品中除亮黑回收率较低为31%其他色素64一99%，各种色素的检出限为0.10.5jg/ml。 5.2 天然色素：β-胡萝卜素 食品中天然的β-胡萝卜素分布很广，本法不能分离食品中的a-，3-，Y-，8-胡萝卜素，因此本法定量值是食品中原有的 α-，B-，y-，8-胡萝卜素和添加的β-胡萝卜素的总和。 色谱条件 柱：内径2.1mm长度50cm 填充剂：多孔性聚合物。 流动相：甲醇+二氮甲烷+正已烷(10+7+3) 柱温：40℃ 流速：0.5ml/min 测定波长：453nm 6 甜味剂 这是一种十分重要的食品添加剂，一般分为两种：营养型和非营养型，营养型主要包括各种糖类、糖醇类；非营养型主要包括糖精钠与甘草等，可用于多种食品。 甜味素 APM、甜蜜素AK、糖精钠SA 的测定方法8.： 此三种甜味剂，甜度高、口感接近蔗糖，现已广泛用于餐桌甜味料、饮料、增香牛奶、可可制品、饼 干、泡草莓多种食品中。 样品经固相萃取法与透析法，净化样品溶液后待测。 色谱条件 柱： Finepak SIL CigS(4.6mmx150mm，5pm) 流动相：甲醇+水(2+8)含0.03ml/l 的 TEA-OH用磷酸调 pH=4.0。 流速：1.0ml/min 波长：210nm 注入量：10pl 本方法在碳酸饮料、苹果汁、草莓汁、乳酸菌饮料和罐装咖啡、乌龙茶6种饮料中分别添加以上三种甜味剂50pg/g、200pg/g其回收率 AK：95-102%；SA93-104%；APM：90—102%检测限均为10ug/go 7 调味剂 调味剂是能赋予食品甜、酸、苦、辣、咸、鲜、麻、涩、清凉等特殊味感的一类食品添加剂。但以能刺激味觉受体的呈味物质为限，不包括能刺激嗅觉的物质(香料)一般分为甜味剂、酸味剂、苦味剂、味和代盐剂、鲜味剂及其它调味剂等。 L一天冬氨酸一钠12：仅次于L一谷氨酸钠(味精)的一种氨基酸类鲜味剂，世界年消费量在250吨以上，多用于咖喱、醋、鱼类罐头、面包、饼干、饮料之中，与糖精钠合用可掩其苦味、食品中的L一天氨酸-钠用 HPLC定量天冬氨酸乘以分子量比，求得L一天冬氨酸一钠的含量。 色谱条件 用 HPLC 氨基酸自动分析仪。 填充剂：凝胶型强酸性阳离子交换树脂，平均粒度17pm交联度8%。 柱：内径9mm 长度 50cm 柱温：55℃ 波长：570nm 流动相：柠檬酸缓冲溶液(pH3.25)0.6ml/min 反应螺旋管：内径0.5mm长度20mm 反应槽温度：98℃ (水合)茚满三酮液流速：0.3ml/min 8 品质改良剂 亦称组织改良剂，是一类通过保水、粘结、增塑、稠化、增容及改善流变性能等作用以改进食品的组织结构和口感的一类添加剂。 过氧化苯甲酰°是面粉改良剂中的一种，它与面粉中的胡萝卜素等色素发生作用，使其变为无色物质，从而提高面粉白度。同时还能抑制小麦粉的蛋白酶活性，避免蛋白质的分解，以提高面粉的贮藏 性能，但使用过量可形成苯环基与OH-结合成有害的苯酚。 样品经丙酮、冰乙酸、碘化钾、乙醇的混合溶液稀释离心后取上清液过0.45um滤膜后待测。 色谱条件 柱：NOVa- pak Ci8 (3.9mmx 150mm) 流动相：甲醇+0.02mol/l乙酸铵(5+95) 流速：1ml/min 波长：UV230nm 进样羊：10g 该方法平均回收率：98.5% RSD=3.28%最低检出浓度 0.004g/kg。 9 香料 亦称“增香剂”是一类能使嗅觉器官感受出气味的物质。 香豆素10又又称邻羟基桂酸内酯和1.2一苯丙吡喃酮是主要的豆香型香料之一，常用于香薇、素心兰、紫罗兰等香型的日用香精中，对小鼠胚胎有毒性，对大鼠为可疑致肿瘤物，对人体肝脏也有危害，不得用于食品中。 二氢香豆素是以香豆素为原料，经催化加氢制得，是调配奶油、椰子、樱桃等香型的食用香料，因在生产过程中有可能带香豆素造成食品污染而有必要对香豆素的含量进行检测。 样品用无水乙醚萃取，在40℃水浴上用氮气吹干.残留物用甲醇+水(9+1)反萃取。 色谱条件 色谱柱：Cg反相柱(3.9mm×150mm，5gm)。 流动相：甲醇+0.01mol/1磷酸二氢钠溶液(pH5.4)(45+55) 流速：1.0ml/min 柱温：35℃ 波长：UV275nm AUFS：0.02 本方法最小检出限：0.015mg/1 回收率：97.6%-100.8%。 综上所述，食品添加剂种类繁多，而且发展速度迅猛，但过去对其检验的手段耗费大量的人力、物力，而用 HPLC 法测定食品中的添加剂方法快速、准确，重现性好，特别是可进行多组份同时测定。能有效的利用各种资源，节约人力、物力、缩短实验时间，降低实验成本，提高实验结果的准确度，尽管其可检验食品添加剂的种类不是很多，但随着社会的发展和技术的完善，应逐步取代传统的检验方法，而成为食品添加剂检验的重要手段。 肝炎新病毒——TT病毒研究进展 甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒是引起人类肝炎的病毒，然而还有一些肝炎病人查不出上述的几种已知病毒的血清学标志，可能潜在着其它病毒的感染。用描述性差别分析，最近，从不明病原的肝炎病人中分离出的两种新的病毒：一是从非甲——非丙型肝炎病人中分离出了 GBV-C/庚型病毒(HGV)，但进一步研究表明，GBV-C/HGV 并不是非甲——非型型肝炎病例的主要原因11.2。二是从日本不明病原的输血后肝炎病人中克隆出了一种新病毒——TTV(TT 为该病人的名字)1.3]，以前曾有人定为输血传播病毒(TTV)，看来是不正确，对 TTV 的研究各地陆续有报告，究其致病性和流行病方面的研究均还没有定论，现将研究近况综述如下。 1 病原学和致病性研究 TTV病毒为单链 DNA病毒，无包膜，基因是由3739对碱基组成，具有两个开放性读框，分别为ORF 和 ORF，，能别能编码770和202个氨基酸。虽然有一些资料表明 TTV与细小病毒相似(依据是该病毒缺乏外膜包裹)[4]，但两者的基因顺序没有明显的同源性。从开放性读框顺序的种系发生树分析，目前，对 TTV 至少可分四个基因型，SimmondsP.等，报告了三个基因型(G1、G2、G3)15J，后来Yasuhito T.等人在哥伦比亚印地安人中发现了第四个基因型(G4)，并发现先前报告的G型中还存在两个亚型，即G和G2a61。 对于 TTV 在肝病中的致病性，目前各家报告不一，这可能与所研究的人群受一定限制有关，如自 ( 参考文献 ) ( 凌关庭，等.《食品添加剂手册》.第二版 ) ( (日)食品卫生协会.《食品卫生检验手册》.添加剂分 册 ) GB/T5009.29-1996食品卫生检验方法.检验部分46 ( 刘淳，郑毅，等.《中国卫生检验杂志》.1998；8(6)380 ) ( 葛宝坤，等.《中国卫生检验杂志》.1999；9(3)218 ) ( 胡小钟，余建新，孙国保，等.《分析测试学报》1999；18 ) 1997年日本的输血后肝炎病人分离分 TTV 以来，多数研究者同研究 HGV 一样，只是在各型肝炎病人及献血员中作观察，其结果似于 TTV 感染加重于其他类型肝炎病情，并与 ALT升高有关。 Nishizawa 报告的供血员及各型肝炎病人中 TTV 感染情况7。非甲——庚型慢性肝病患者中检出率为46%；非甲——庚型爆发性肝炎患者中为47%；慢性肝炎为47%；肝硬化为48%；肝细胞癌为39%；血友病患者为68%；静脉吸毒者为40%；血透析病人为46%；献血员为12%。同时观察了3例非甲——庚型输血后肝炎炎TTV.DNA阳性病人，证实有2例TTV.DNA 滴度与 ALT 升高有关，于 ALT 达高峰前2—4周 TTV.DNA 阳转。北京地坛医院病毒研究中心何忠平观察了291例各型肝炎病人 TTV 感染情况18，TTV 阳性率为13.7%，其中甲—---戊型肝炎患者中 TTV 阳性率为5.3%，非甲一戊戊型肝炎为27.7%、庚型肝炎为15.0%，英国报告慢性肝病中TTV 阳性率为25%9，明显低于日本检测的结果。但英方报告多数 TTV 阳性的病例有生化和组织学肝损害的证据，以上结果并没有排除肝损伤是由其它型别的肝炎病毒所致。Hisayoshiw.等人在日本的雅摩格达县做了一规模较大的一般健康人群的观察110，探讨了 TTV 感染与 HCV感染和 ALT 异常的关系，结果表明 TTV.DNA 阳性率与 HCV感染无关，并发现ALT异常者中抗——HCV阳性率高于TTV.DNA 阳性率，在单项 TTV.DNA 阳性者和TTV.DNA及抗-j——HCV 双项阴性者中ALT 的水平无明显差异。提示一般人群中肝功异常是由于 --一---- ( (5)21~23 ) ( [7] 石川小才，等.食品卫生学杂志(日)17.1996；37(5) 281~287 ) ( 安贵子，等.食品卫生学杂志(日).1989；30(2)164 ) 8冯雪顺，等.《中国卫生检验杂志》.1999；9(6)421 ( )] 陈捷，等.《色谱》.1999；17(2)203 ) ( (2000-06-08收稿) )