切向流过滤：血红蛋白纯化

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在现代医学中，输血是出血性休克、贫血等病症重要的治疗方法，也是常规手术的重要组成部分，但是肝炎及 AIDS 等小概率传播风险，总是干扰着输血的安全进行。此外，输血前，还需对供体血液进行分型，并与受体血型交叉匹配，以避免出现排异现象。对此，一种相对简便的替代方法是，使用血红蛋白(Hb)类氧载体 (HBOCs)取代供体红细胞(RBCs)，其具有以下优点：首先，由于 HBOCs表面没有血型抗原，一般不会引起排异现象；其次，在Hb纯化过程中灭活并清除了病毒，所以大大降低了血源性疾病传播的可能性。 Hb 通常从人或牛 RBCs (hRBCs 或 bRBCs) 中提取。对纯化的 Hb进行化学修饰是 HBOCs 合成的一种主要途径，化学修饰型 HBOCs 可以通过分子内交联 Hb、聚合 Hb或将聚合物结合到 Hb 表面的方法来完成。Hb也可以包埋到固体或中空颗粒内部，以形成非化学修饰型 HBOCs。 从裂解的 RBCs 中提取并纯化 Hb 前，需先去除血液中的白细胞、血小板及血浆成分，可先离心并漂洗血液，以分离血浆和白细胞层。所得的 RBCs再用低渗溶液孵育裂解。 从RBC裂解液中纯化 Hb 的方法有很多种，包括有机溶液萃取以及离子交换色谱分离。色谱方法又可以大体归类为吸附方法(Hb 被截留在固相介质内，然后溶剂洗脱)或直流方法(杂杂被截留，而Hb被洗脱)。直流方法消除了吸附和洗脱过程，但与吸附方法相比，所得的Hb纯度较低。但两者都受到血细胞裂解方法及裂解状态的影响。 在还原剂存在的绝氧条件下进行加热，也可以进行 Hb 的纯化。在该过程中热敏感性蛋白选择性沉淀，而病毒被灭活，但Hb也有可能因为高温而失活，所以需要添加稳定剂，以防止 Hb变性。 微滤和超滤也是 Hb 纯化的常用技术，可有效降低 Hb 溶液中的病毒载量。但是常规的过滤技术通常需要配合化学修饰和分馏操作，以从未修饰型Hb 和其它杂质中分离修饰型 Hb， 且由于细胞碎片堵塞膜孔，造成流速降低。针对这些问题，本文将介绍一种多阶段式过滤方法。在该方法冲，大多数细胞碎片在第一阶段 (膜 MWCO 50nm) 被清除，然后连续过滤，逐步清除较大的细胞碎片和分子。该技术相对简单，且可同时进行 Hb 的纯化和浓缩。 材料& 方法 RBCs 溶液起始处理量为1，000 mL， 离心后，用等渗盐水漂洗去除非细胞性 Hb和血浆蛋白，再用PB溶液冰浴裂解 RBCs， 裂解液终体积为2，000mL。 仪器使用 KrosFlo 研发用 Ili 切向流过滤系统(SYR2-U20-01N)和4根中空纤维过滤组件，组件MWCO 规格分别为 50nm(M10S-360-01P)、500kD(M1-500S-260-01N)、100kD (M1AB-360-01P)和50kD (M15S-360-01P)。系统设置如图1。组件使用前用去离子水完全浸湿，并进行完整性测试。 在每个过滤阶段，收集滤液，并循环回流液，以提高 Hb 产量。但在阶段Ⅲ，1L的PB溶液进行洗滤操作。整个纯化工艺在生物安全柜内进行，滤液及回流液容器置于冰上。每个阶段开始和结束时 多阶段 HF 过滤系统模式图 测量滤液流速和跨膜压，并在各阶段处理结束后，从滤液中取出 10ml， 做进一步分析。阶段1起始过滤量为 2，000 mL RBCs 裂解液。每次运行结束后，HF 组件、相关软管和容器均用 0.5M NaOH 溶液清洗，以清除可能粘附到 HF 膜上的蛋白，并降解可能存在的内毒素。 使用 Bradford、紫外可见光谱、质谱等方法对纯化所得的 Hb 进行质量检测。 结果 &讨论 由于浓差极化的原因，在 Hb纯化的每个阶段，滤液流速和回流液体积都会随时间降低。浓差极化是由于大分子或颗粒积聚在 HF膜表面， 形成滤饼层，即使在 HF 膜没有发生物理性堵塞的情况下，滤饼层的形成也会降低分子穿过膜的速率。在前两个阶段，大部分蛋白质通过 HF膜，进入滤液容器，而细胞碎片和大分子则浓缩回流，部分细胞碎片会堵塞 HF膜孔，提高跨膜压，降低流速。在阶段Ⅲ，大部分 Hb 被截留在回流液中，而部分 Hb (αβ二聚体)进入滤液。 KrosFlo 研发用 Ili切向流过滤系统及 HF过滤组件 蛋白浓度分析显示，大部分 Hb 截留在阶段Ⅲ(膜MWCO 100kD) 的回流液中，浓度约为 5mM，显著高于离子交换色谱色法(0.7-1.7mM)， 而metHb 水平(~0.5%)低于离子交换色谱方法(0.5%-2%)。纯化的 Hb 中，内毒素水平亦低于 RBCs 原液，内毒素主要为脂多糖(~10kD)，可在阶段 Ⅲ(100kD HF 膜) 轻松过滤去除。 SDS-PAGE 显示，大多数杂质在阶段1和Ⅱ即可去除，而在阶段Ⅲ，通过连续洗滤，可显著降低杂质含量。在平衡氧结合特性分析中，纯化的 Hb(100kD 回流液)各测量值均与 RBCs 接近， 说明 TFF 过程未改变 Hb 特性。 对阶段Ⅲ回流液内容物进行质谱检测，结果显示，α、β球蛋白链及其聚合物分子量检测值与理论值保持一致，说明 Hb是阶段Ⅲ回流液中的主要成分。 切向流过滤是一种实用、快速的 Hb纯化及浓缩方法，与其它方法相比，所得 Hb纯度较高，且metHb 水平较低。同时，调整阶段Ⅲ的洗滤体积，可进一步提高 Hb 纯度。 ( References： ) ( 1) Palmer， A . F.， e t a l.. Tangential Flow F iltration o f Hemoglobin.Biotechnol. P rog.， 2009， Vol.25， No.1. ) ( 2) Elmer， J.， e t a l.， Purification of hemoglobin by ta n gential fl o wfiltrati o n with diafiltrat i on. Biotechnology Progess. 2009， Vol. 5， No.25. ) ( 3 ) R eis， R. V .， et al.， H i gh-Performance tangential flow filtra t ion usin g charged membranes. Journal o f Membrane S c ience. 1999， Vol.159，No.1-2. ) Application NoteSpectrum Laboratories， INC. Application NoteSpectrum Laboratories， INC.For Use of Spectrum and Authorized Distributor