人参中皂苷检测方案

智能文字提取功能测试中

厂纳诺仪器nano instrumentShanghai Nano Industrial Co.，Ltd. Shanghai Nano Industrial Co.，Ltd. 方法开发系统在建立6种人参皂苷 UHPLC分析方法上的应用 摘要：本文建立了一种使用岛津 HPLC 方法开发系统对6种人参皂苷类药物高效液相色谱快速分析条件探索的方法。在人参皂苷Rb1等6种药物的高效液相快速分析方法开发中，实现在4种色谱柱、2种流动相体系、16种梯度条件间的方法探索，根据所得色谱图结果对各峰进行综合评价，最终确定峰检出数和分离度综合评价最优者为该样品分析方法。 关键词：超高效液相色谱方法开发系统药物分析人参皂苷 人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物，主要存在于人参属药材中，具有增加白细胞数量、提高人体免疫力、促代谢、抗疲劳、抗衰老和抗肿瘤等作用。在对人参皂苷分析研究中，由于化合物结构相似的缘故，传统的 HPLC 方法耗时长，分离效果不佳，随着现代液相色谱技术的高速发展，开发超快速液相分析方法进行人参皂苷检测显得尤为重要。 岛津 HPLC 方法开发系统是基于其最新一代超高效液相色谱仪 LC-30A 建立的-套用于液相分析条件探索的自动化装置。它利用工作站控制自动进行色谱柱切换和流动相配比而实现了原本需要人力干预才能完成的分析方法开发过程。该系统配备的Method Scouting Solution 工作站将繁琐的条件变化设置过程大为简化，图形界面易于操作和理解。 文中使用该套系统，自动筛选合适的色谱柱和流动相比例建立了快速检测 Re， Rg1， Rb1， Rb2， Rc， Rd 共计6种人参皂苷的UHPLC 分析方法。 nit 图1方法开发系统流路特点 1.实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 系统。具体配置为 LC-30AD×2(输液泵，配四元低压梯度比例阀)， DGU-20A5R×2(在线脱气机)， SIL-30ACMP(自动进样器)， CTO-20AC(柱温箱，含FCV-34AH(高压流路切换阀))， SPD-M30A(二极管阵列检测器)， CBM-20A(系统控制器)，Method Scouting Solution Ver. 1.00(方法开发系统工作站，) LabSolutions Ver. 5.54SP1(色谱工作站)。 1.2.1方法建立的流程 图2应用方法开发系统进行色谱方法建立的流程 1.2.2液相色谱条件 色谱柱： InertSustain ODS 3.0 mmI.D.x100 mmL.，3 um Shim-pack XR-C8 2.0 mmI.D.x100 mmL.，2.2 um Shim-pack XR-ODS II 2.0 mmI.D.x100 mmL.，2.2 um Shim-pack XR-ODS I 2.0 mmI.D.x150 mmL.，2.2 um 流动相：A 相一水 B相一乙腈 流 速：0.4mL/min 进样体积：3 uL 柱 温：40℃.55℃ 洗脱方式：梯度洗脱 检测波长：203 nm 1.3样品制备 分别称取一定量的人参皂苷Re， Rg1， Rb1， Rb2， Rc， Rd， 以甲醇溶解分别得到 1 mg/mL的储备液，吸取各单标储备液以甲醇-水(1：1，V/V)稀释得到100 ug/mL 的标准溶液，经0.22 um 滤膜过滤后进样分析。 2.结果与讨论 2.1通用梯度时间程序分析 以表1所示的通用梯度时间程序对四种色谱柱在水-乙腈流动相体系下进行测试。 表1通用梯度洗脱时间程序(柱柱40℃) Time(min) Module Command Value 0.01 Pumps Pump B Conc. 5 0.50 Pumps Pump B Conc. 5 3.50 Pumps Pump B Conc. 95 mAU C3 C4 图3 6种人参皂苷在通用梯度条件下的色谱图 C1： InertSustain ODS 3.0 mmI.D.x100 mmL.，3 um C2： Shim-pack XR-C8 2.0 mmI.D.x100 mmL.， 2.2 um C3： Shim-pack XR-ODS ⅡI 2.0 mmI.D.×100 mmL.， 2.2 pm C4： Shim-pack XR-ODS ⅢI 2.0 mmI.D.x150 mmL.，2.2 um 2.2 通用梯度分析结果评价 对2.1中通用梯度分析结果评价，依据为峰检出个数同分离度等参数的综合得分 表2通用梯度条件下4种色谱柱上的分离结果评价 peak# Corrected Resolution* C1 C2 C3 C4 1 - - - 2 0.3 3.0 0.3 0.4 3 3.0 1.4 3.0 3.0 4 1.0 1.2 1.5 1.5 5 0.5 3.0 1.2 1.2 6 2.5 - 3.0 3.0 S* 44.2 43.0 54.3 54.8 Corrected Resolution*：各峰分离度中大于3的以3记，不足3的以实际计算结果记。 S*：综合得分，以峰检出数×各峰分离度之和。 根据通用梯度各分析条件下分析结果的评价，最终确定的样品分析色谱柱为 C4，即为：色谱柱： Shim-pack XR-ODSIII 2.0 mmI.D.x150 mmL.， 2.2 um 2.3梯度条件筛选 由通用梯度时间程序分析结果确定了用于分析6种人参皂苷的色谱柱和流动相，为增加分离度和改善分离效果，进行梯度条件筛选。因此在通用时间程序的基础上，按表3优化梯度程序中的初始浓度和终止浓度，总共考察4×4=16种梯度条件。 表3梯度条件设置 0.01 min-初始浓度(%) 3.00 min-终止浓度(%) 5 95 2 15 85 3 25 75 4 35 65 2.4梯度条件筛选结果分析和评判 对16种梯度条件下6种人参皂苷的分析结果，通过 Class-agent report 软件进行峰检出数和分离度自动综合评判。 表4梯度优化分析结果评价 Corrected Resolution* # 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13) 14) 15) 16) %B 5-95 5-85 5-75 5-65 15-95 15-85 15-75 15-65 25-95 25-85 25-75 25-65 35-95 35-85 35-75 35-65 1 - - - - - - - - - 2 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.3 0.3 0.4 0.5 0.7 0.6 0.6 3.0 3.0 3.0 3.0 3 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 4 1.6 1.7 1.9 1.9 1.7 1.7 1.9 2.1 1.9 2.0 2.3 2.5 3.0 3.0 3.0 3.0 5 1.3 1.4 1.5 1.6 1.4 1.4 1.6 1.8 1.6 1.7 1.9 2.1 - - - 6 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 一 - - - S 55.9 57.2 58.9 60.1 56.7 57.0 59.4 61.7 59.7 62.9 64.9 67.5 36.0 36.0 36.0 36.0 S*：综合得分，以峰检出数×各峰分离度之和 图4梯度条件筛选综合评价 根据分析结果评价系统统计结果，筛选出梯度条件为 25%-65%B 进行下一步优化。 图5 6种人参皂苷在梯度条件筛选时的色谱图 2.5梯度条件优化 对2.4中确定的梯度条件 25%-65%B 为基础，对条度条件进行优化，目的以提高保留时间较小的两种人参皂苷的分离度，采用保持2 min 等度洗脱的方式，如表5所示，优化时间程序中0-2min 时B%。 表5梯度条件优优设置(柱温55℃) 2 min-初始浓度(%) 5 min-终止浓度(%) Peak2 保留时间 Peak2 分离度 1 24 65 4.23 0.7 2 26 3.11 1.4 3 28 1.83 1.8 4 30 1.52 1.7 综合考虑 peak2 分离度和保留时间， 0-2 min 选择28%可在合理的保留时间内获得更高的分离度，再对5 min 终止浓度进行考察，如表6. 表6梯度条件优化设置(柱柱55℃) 2 min-初始浓度(%) 5 min-终止浓度(%) 评价系统结果S 1 28 75 75.4 2 70 77.5 3 65 79.4 4 60 80.1 通过对梯度条件的优化，根据评价系统统计结果，选择为 28-60%B方式为最优方法。 梯度优化过程对初始浓度和终止浓度分别先后进行考察，用尽可能少的步骤完成优化过程。 2.6分析条件的确定 通过 HPLC 方法开发系统对6种人参皂苷的 UHPLC分析方法进行探索，经过两种实际样品(高丽红参，生脉注射液)验证，将终止浓度调整到55%可以提高实际样品中极性较小区域杂质的分离度，因而最终确定的液相色谱分析条件为： 色谱柱： Shim-pack XR-ODSII 2.0 mmI.D.×150 mmL.， 2.2 um 流动相：A相-水，B相-乙腈 流速：0.4mL/min 检测波长：203 nm 柱温：55℃ 进样量： 3 uL 梯度洗脱时间程序：表5 表6梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.01 Pumps Pump B Conc. 28 2.00 Pumps Pump B Conc. 28 4.50 Pumps Pump B Conc. 55 7.00 Pumps Pump B Conc. 55 7.01 Pumps Pump B Conc. 28 9.00 Controller Stop 上海纳诺实业有限公司ShanghaiNano Industrial Co..Ltd. 图66种人参皂苷对照品溶液 UHPLC 色谱图 2.7含人参皂苷的中药及制剂样品分析结果 图7高丽红参甲醇提取液的 UHPLC 色谱图 图8生脉注射液的UHPLC色谱图 3.结论 使用岛津 HPLC 方法开发系统建立了 Re、Rg1等6种人参皂苷超高效液相色谱分析方法，利用 Method Scouting Solution 工作站控制来自动实现色谱柱切换和流动相梯度比例调整，通过 Class-agent Report 报告生成软件自动进行分析结果中峰检出数和分离度综合评估从而筛选最优条件。分析结果显示，6种人参皂苷在10分钟内实现基线分离，各峰分离度均能达到1.5以上，从而为液相分析方法的快速开发提供了一种有效的手段。 邮编：201108