荧光颗粒物中显谱、尺寸和数目检测方案(其它光学测量)

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应用指南 有荧光性或者荧光标记的纳米颗粒的显谱、尺寸和数目 简介 荧光分子一直专门用于标记复杂混合物和基体中具有特殊结构和功能的物质，以确定他们是否存在及其空间分布。在有机分子的发展历史中，人们发现了许多这样的荧光物质，不同的适用范围决定了这些荧光物质的选择性。 背景 荧光分子由于其不同的结构和性质具有特定的激发和发射光谱，而在不同的化学/溶剂环境中具有不同的溶解度和稳定性以及不同的量子化产率和荧光猝灭作用。它们能通过选择性滤光器实现与没有标记分子的背景的区分，从而允许用户识别和量化几乎任何类型的结构。这样一来，既可以通过具有特异性的抗体，核酸片段或其它结构与目标分析物绑定来间接测定，又或者作为一种直接荧光剂利用其亲和力对脂肪、糖类、蛋白质等物质直接测定。最近，出现一种新的半导体纳米晶体发光物质，又叫量子点，因其能够显著增强发光、化学稳定性和抗荧光猝灭作用而被应用。这样一来，在整个生物分析科学中都使用了荧光物质。 采用 NanoSight 的纳米颗粒跟踪分析仪观察荧光纳米颗粒 NanoSight 的 LM 系列的新型荧光仪器不仅能够实时跟踪单个荧光纳米颗粒还能测定标记的颗粒尺寸大小和浓度。在光散射模式下可以测定颗粒物总数，然后在荧光模式测定时与标记颗粒物浓度进行对照。 NanoSight 系统采用405nm(蓝色)还是或者532nm(绿色)的激发光源，激发适当的荧光物质，然后采用 430nm 和560nm匹配长通滤波器分别测定这些荧光物质的荧光性。 例如，一份含有粒径100nm的荧光物质(FluoresbriteTM， PolySciences公司)和粒径400nm的非荧光聚苯乙烯颗粒校准品的混合物，在散射光下测定(图1a)，然后通过一个荧光滤光器(图1b)。在散射光照射下观察荧光和非荧光颗粒尺寸大小并计数，但是通过荧光颗粒滤光器后只可观测到100nm的荧光颗粒。 请注意，它也可能保留荧光标记的纳米颗粒的浓度信息用于比较标记能力。 图1：粒径为100nm 的荧光物质和 400nm的非荧光聚苯乙烯颗粒混合物在a)散射光模式和 b)荧光(光学滤过)模式下分析的粒度分布图(黄色图)。 采用 NanoSight 的纳米颗粒跟踪分析溶液中单个量子点(QDots@)的特仪分析荧光纳米颗粒 NanoSight的LM系列的新型荧光仪器不仅能够实时测定单个荧光纳米颗粒尺寸大小还能同时对它们进行计数。 如：粒径为100nm的荧光标记物质 (Fluoresbrite)和粒径为100nm的未标记的聚苯乙烯微球为50：50的混合物在散射光模式下(红色线和最上面的图片)和荧光过滤后(白线和底部的图像)进行分析。 颗粒大小图2 下表显示，虽然尺寸大小相同，但是通过过滤器后只能观察到总数中观察到总数中有荧光标记的颗粒数目，数量较之前有所下降。 图3 殊测定 最近出现的半导体纳米晶体由于具有很好的化学稳定性和光学稳定性并且易于使用，从而作为一个强大的有吸引力的替代物质来取代荧光标记物。现在，商业上已经将其作为带有可选择发射波长的预备功能配套元件使用，这些有吸引力的材料在生物科学的普及中正迅速增加。成像时往往是固定的(长期在显微镜下观察或者标记更大的结构(例如多孔结构))，但是NanoSight的LM系列中新的荧光仪是首个可以在自由的布朗运动下对量子进行观察、测量以及计数。 下面的例子是缓冲液中对Invitrogen公司的非功能QD655 QDot纳米晶体悬浮液的分析。使用NanoSight的405nm(蓝色)的激作作为激发光源，通过合适的滤光器，可以在60秒内观察到这些655nm处发出的单个量子点的结构、尺寸和数目。 10-12nm无涂层的量子点 15-20nm 有生物分子涂层的量子点 图4 应用指南 下图是一个功能化量子点样品，显然样品中初始粒子之间通过价键结合。注意较小的峰值模式与蛋白质涂层量子点的尺寸相容，但聚合物(多聚体)也出现了。 主要特点 颗粒的尺寸大小和数目可以在两种模式下进行测定：散射光模式和光学滤光器(荧光) 还要注意的是，有轻微的证据表明有粒径为 14nm 的非功能化量子点的存在。此峰的真实性需要进一步的分析证实。 需要的样品体积小 仪器成本低 可实现单个荧光颗粒的可视化 ●具有快速分析能力并且其团聚作用和稳定性不随时间变化而变化 荧光过滤器可用于405nm和532nm的激光光源* *滤光器的设置可联系NanoSight公司。 430mm长通滤光片 颗粒大小 图5 100.00%90.00% 80.00%70.00%60.00%50.00%40.00% 30.00%20.00%10.00% 0.00%-10.00% 100200300400500600700800 荧光标记分析亚微米级生物结构 565nm 长通滤光片 最后，如图6所示，对一份具有临床意义的微孔和纳囊泡结构样品使用适当的荧光物质结合抗体进行特殊标记，在微孔中对分子抗原进行免疫。根据荧光分析显示红色的图表示微孔数目，绿色表示所有标记和未标记的结构。 100.00% 80.00% 60.00% 40.00% 20.00% 0.00% 20.00% 100 200 300 400 500 60010700800 联系方式 欲了解更多信息，请联系NanoSight或者当地经销商，请登入^www.nanosight.com 图6 Nanosight Ltd， Minton Park， London Road， Amesbury， Wiltshire， SP RT， UKT： (+ () F： (+ ()E： enquiries@nanosight.co.ukwww.nanosight.com T： (+ () F： (+() E： enquiries@nanosight.co.ukwww.nanosight.com