苯丙胺中结构分析检测方案(核磁共振)

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使用台式核磁共振波谱仪分析违禁药品：苯丙胺 Dean Antic博士，赛默飞世尔科技，美国科罗拉多州博尔德 关键词 违禁药品，策划药，苯丙胺，案例案品， SOP， 核磁谱图参考数据库，推定实验 简介 在应对毒品走私时，缉毒署所要面临的挑战是种类繁多毒品的不断涌现。某些违禁药品的合成类似物尚未受到管控，毒贩生产这类合成类似物的目的是避免检测，绕过边境管制。随着类似物毒品的不断增加，地下实验室通过对药物分子的官能团或其位置稍微进行修改，即可合成各类违法药品的衍生物，进而生产出结构相似而功效增强、特异性提高的毒品，几乎每周都会有新的毒品变体出现。 海关和邮政的毒品稽查缴获了种类丰富的违法或者不能确定是否合法的合成策划药。有几大类的毒品种类越来越丰富，特别是苯乙胺和卡西酮两种药品的类似物，多泛滥于边境，导致这种现象的部分原因是，在立法上这些结构类似物的合法性定义比较模糊。结果是出现了各种令人眼花缭乱结构类似的毒品，这对已有的快速检测法和推定实验方法是个较大的挑战。现有方法在对违禁药品进行初步鉴定时缺乏特异性。 推定实验湜确定样品为何种物质的一种分析方法。现有方法包括比色实验，红外光谱法(IR)和薄层色谱法(TLC)。不论是现场检测是实验室检测，比色实验的操作都较简便，因而是推定实验中常用的一种方法。但比色实验较容易得到假阳性或假阴性结果，并且识别检测策划药所需的区别能力，或者说缺少“结构灵敏性”(structural sensitivity)。红外光谱法是一种快速筛选技术，可以提供更多化学组成信息，因此其具有更强的区别能力，而红外测试手持设备也具有便携的优点。红外光谱实验得到的振动光谱需要与 谱图数据库进行对比。面对不断涌现的新策划药，谱图数据库需要时常更新。这种技术在分析混合物时也受到限制。薄层色谱法是一种色谱分离方法，也是一种比色方法，最好用于纯样品或掺假样品(cut sample)的检测。 对药品进行初步识别时，需要具有高时效性且快速的筛选方法，该方法应具备较高的结构选择性和区别能力，能够确认策划药的种类。核磁共振技术(NMR)具有结构选择性和较高的区别能力，可以较好地满足这样的检测要求。核磁共振技术与GC-MS和GC-FTIR一样，属于几种验证实验技术之一，可用于得到确定的定性和定量分析结果。高场核磁共振(1HNMR)仪器也可用于验证实验，但其价格昂贵，承担的实验任务繁重，需要集中使用且资源有限，对于样品现场快速分析来说成本昂贵。 Thermo scientific'lM picoSpinTM 80 核磁共振波谱仪是一款价格合理、使用方便、结构紧凑的台式仪器。核磁共振谱图数据易于分析，能够反映出分子化学结构中的微小区别。药品分子中的关键官能团能够决定药品所属种类，例如苯丙胺类物质等，这些官能团使得每类药品有独特的核磁共振特征峰，可用于药品类别的区分。改变分子官能团的种类或者位置，会使其核磁共振谱图发生相应的不同变化，在特定的灵敏性条件下，可依此对特定药品进行鉴别。 使用台式核磁共振波谱仪对合成药品进行有效的快速 筛选识别，这需要备有一个数据量不断增加的参考物谱图数据库，甚至是参考物子类物质的谱图数据库。母体结构的核磁共振特征信号可用于识别物质种类，区分同种类别中的不同衍生物。使用标准方法来进行样品制备和分析时需要考虑到案例样品分子结构、溶解度和化学组成上的差异，从而将最终谱图的复杂程度降到最低。 使用 picoSpinTM 80台式核磁共振波谱仪开发出一套标准操作程序(SOP)， 用于采集一系列苯丙胺衍生物和甲基苯丙胺衍生物的核磁谱图，建立谱图数据库。利用化学结构特征来区别不同物质种类，进行物质结构确认。然后根据谱图数据库来检测了几种已知和未知的案例样品。 针对苯丙胺类物质(ATS)建立了一套参考药物样品和几种案例样品的氢谱核磁数据库。被测样品(图1和图2)包括苯丙胺(1)， PHA(1a)，2，5-DMA(1b)，DOB (1c)，MDA(1d)，2-FA(1e)，4-FA(1f)， 甲基苯丙胺(2)，MBDB (2a) 和MDMA(2b)，以及案例样品甲基苯丙胺、MDMA和一种未知样品。 样品测试建立SOP需要考虑三方面的因素：1)溶剂：2)样品浓度和3)采样时间。选择溶剂时需要考虑以下几个因素：信号重叠性，溶解度和毒性。重水(D，O)毒性小、无核磁信号(2H核的自旋量子数为1)并且可以溶解大量的被测样品，因而本例中选择重水作为溶剂。另外重水还可以与样品分子中的活泼发(例如-OH，-NH，-SH)进行交换，消除核磁谱图中的活泼氢信号，从而简化了样品的核磁谱图复杂性。与许多毒品一样，本例中所有被测样品都为盐酸盐或硫酸盐，这使其在水溶液中可溶解至所需浓度。采样时间为6分钟，足够从核磁谱图中获得所需的定量和定性信息。 图2.案例和参考样品结构 上海皓鸿生物医药科技有限公司 方案1为注入样品的SOP。使用一次性1毫升聚丙烯注射器和22号平头针手动将液体样品注入进毛细管进样系统。前后两次样品注射和数据采集过程之间，依次向毛细管进样系统注入空气/溶剂/空气。此操作可避免样品之间、溶剂之间的不互溶性，同时也防止交叉污染。对于每一个样品的操作都需使用新的注射器和针头。若制备样品时使用不同的溶剂，则需分两步注射溶剂，即空气/溶剂1/溶剂2/空气，其中溶剂1和溶剂2为不同样品所用的溶剂。 本实验的药物样品溶液是在AFP(澳大利亚联邦警察局)的监管下制备的，将5-12毫克样品(实际用量由样品决定)溶解在200微升重水中，配制浓度为250毫摩尔。重水(D，O)中加入0.35%(w/v) TMSP-d作为化学位移内标物。 方案1标准操作过程 使用Thermo ScientificTM picoSpinTM 80 核磁共振波谱仪采集谱图。该仪器场强82 MHz， 是一台永磁傅立叶变换氢核磁共振谱仪，配有带毛细管进样系统的探头。谱仪的毛细管进样系统配有不锈钢微量液体进样接口和出样接口，可使液体样品注入至谱仪的射频(RF)线圈内。进样系统的液体通路是内径为400微米的特氟龙/石英毛细管，该液体通路的总容积为40微升，在射频线圈内的有效容积约70纳升。 每个样品的采样时间为6分钟。所有谱图都采用下列参数：90°激发脉冲，750毫秒采样时间和15秒弛豫延迟时间。选择较长的弛豫延迟时间可进行定量分析。每张谱图的累加次数为25次。每张谱图数据都用MnovaTM 核磁处理软件进行相同的处理，处理采用一套标准的处理参数，包括充零，相位矫正和加窗函数。使用Mnova的全谱去卷积(GSD)功能进行谱峰处理，从而进一步的合成谱图 (synthesized spect-ra)分析。合成谱图 (synthesized spectra)是建立可检索参考谱图数据库的基础，其考虑到参考物化学位移的变化，水峰变化，杂质信号及噪音等因素，因此简化了检索和分析所需的参数。 结果 苯丙胺即a-甲基苯丙胺，分子结构为一个苯环与一个具有三个碳原子的脂肪胺侧链相连。图3为苯丙胺的分子结构和原子标号。苯丙胺的衍生物保留a-甲基-乙基胺侧链(-CH，CH(CH，)NH，)，而苯环部分发生了改 变(见图1和图2)。侧链取代基改变会将ATS变为另一类药物，具有不同的核磁谱图特征峰。例如，苯丙胺上侧链氨基上的一个氢被甲基取代后变为甲基苯丙胺，而将β-亚甲基变为羰基则成为卡西酮(β-酮苯丙胺)，即策划药“浴盐”的母体结构。这两种情况下，ATS的核磁谱图特征信号峰都会改变，可提供识别药品种类更多的信息。药品的谱图特征随母体结构和功能结构的改变而改变。要利用这点进行分析，则参考核磁谱图数据库必须有一个前提条件，即所有谱图必须在一套标准条件下进行处理。要直接进行对比，必须要求相似的样品浓度和溶剂条件。 图3.苯丙胺的结构式 图4为ATS参考样品的核磁谱图库，包括苯丙胺(1)和一系列类似物(1b-1f)的氢谱。根据实验数据对有用的信号进行谱峰标定 (peak picking)， 进而得到“合成谱图”见图5。从原始数据中得到的合成谱图，对给定结构的谱图特征进一步确认，并同时删除了水峰和化学位移参考物的谱峰。 苯丙胺的氢谱比较简单，为指认物质所属药品子类别提供关键信息。α-甲基-乙基胺侧链有一对特征的两重峰(图中用红色框标出)，没有干扰信号时两个两重峰之间相隔约2 ppm。1.25 ppm处的峰为α-甲基(-CH，)信号，其与α-次甲基(-CH-)氢耦合，因此为两重峰。β-亚甲基 (-CH，)的两重峰在3 ppm处，其也与a-次甲基耦合。而α-次甲基既与β-亚甲基耦合，也与α-甲基耦合，因此为多重峰，同时由于其与氨基相连，因此化学位移为3.5-3.75 ppm。但是该峰强度较弱，不能当作特征峰。α-甲基-乙基胺的一对两重峰能够说明ATS属于苯丙胺类药品。 图4.苯丙胺参考样品的实验氢谱(82MHz) 根据芳环区的信号可以确定样品的具体种类。苯丙胺母体结构上未取代的苯环对应着7.4ppm处单峰。环上任意位置的取代基都会破坏苯环的对称性，使单峰的化学位移变化：而根据取代基种类的不同，峰的裂分情况也不相同。以化合物1a，1b和1c为例，这三种物质的芳环区分别对应着两种不同的两个两重峰(1a和1b)、一对峰(1c)，这些峰的化学位移都向高场移动：化合物1d在芳环区有一个高场的单峰：芳环上被氟取代的1e和1f互为位置异构，两者的芳环区信号向低场移动，且芳环上氢与氟原子有耦合作用，裂分情况不同。通过分析芳环的耦合裂分情况得到取代基的信息，从而有助于确定结构。用于指认苯丙胺衍生物的芳环氢信号用蓝色框标出。 如果取代基上有氢原子，在氢谱中会产生新的峰，同样可以为指认衍生物提供信息。例如化合物1b和1c 上的甲氧基 (-OCH，) 都在3.8 ppm左右有信号峰(用绿色框标出)，为一个两个小峰比较靠近的两重峰。1d的苯环上有3，4-亚甲二氧基取代基(-OCO-)，该取代基对应6 ppm处单峰，核磁共振谱图的这一区域一般是烯氢的峰，该取代基的峰比较特殊。这个区域用紫色框标出。 苯丙胺参考谱图数据库建立后可进一步分析案例样品。案例样品包括甲基苯丙胺(2)， MDMA (2b)以及一种未知物。MDMA是一种与甲基苯丙胺很相近的类似物，只是多了一个3，4-亚甲二氧基取代基，其结构与MDA和MBDB(2a) 都比较类似。MDMA与苯丙胺的区别是在α位上多了一个乙基。图2比较了这些结构上的不同点。在参考谱图数据库中增加甲基苯丙胺、MDMA和MBDB的谱图，以便确认案例样品。 图5.苯丙胺参考样品的合成氢谱 图6将化合物1， 1d， 2， 2a和2b的实验核磁谱图与案例样品1-3的谱图进行了比较，图7则为根据实验数据合成的谱图。化合物2和2b各具有一个个-甲基-乙基胺侧链，因此其谱图与苯丙胺类药品的相似，具有一对两重峰的特征。化合物2a和2b分子中的N-甲基取代基的信号在图中约2.8 ppm处，这与苯丙胺类药品的核磁谱图明显不同。MBDB是一个N-甲基-丁胺，其侧链上是α-乙基，而不是α-甲基，因此其核磁谱图没有一对两重峰这个特点。三种物质1d，2a和2c结构相似，但是氢谱不同，十分适合将其与案例样品进行比较。 案例样品的确认应首先从确定其所属药品子类开始，即确认其是否属于苯丙胺、甲基苯丙胺或者其他种类。根据化合物1，1d， 2， 2a和2b的谱图组成的参考谱图数据库，比较侧链的信号峰，见图7中的红色方框区域。通过与MDMA的谱图相比，可知案例样品1和案例样品3的谱图与MDMA的谱图十分相似。两个案例样品都有一个两重峰，图中在最右边的框中标出，同样案例样品2也有这个两重峰。在左边的红色框区域内，案例样品1和案例样品3具有一个较强的单峰和一个较弱的两重峰，而案例样品2则为一个单峰和一个三重峰，案例样品2的出峰情况与甲基苯丙胺比较相近。 图6.案例样品和参考样品的实验实谱 (82MHz) 案例样品1和3与MDMA比较相近， 案例样品2与甲基苯丙胺比较接近。芳环上的取代基能够进一步确定归属。三种案例样品的谱图中都没有甲氧基基团(见绿色框内)，而案例样品1和3的谱图中有3，4-亚甲二氧基取代基的特征峰，即6.0ppm处的信号(紫色框内)，案例样品2中则没有。最后分析芳环氢的出峰情况(蓝色框内)，根据6.7 ppm处的单峰可进一步确认案例样品1和3与MDMA属于同类，而案例样品2 的单峰在7.4 ppm处，这与甲基苯丙胺相同。 通过分析谱图中三个区域的信号峰指认三种未知的违禁药品的种类。分析侧链的信号说明了药品所属的大类，官能团分析、芳环区化学位移和取什基分析说明了药品的具体种类。案例样品1为MDMA，案例样品2为甲基苯丙胺，案例样品3是未知样品，最终确定为MDMA. 图7.案例样品和参考样品的合成氢谱(82MHz) 结论 Thermo Fisher Scientific推出的台式picoSpin TM 80 H核磁共振波谱仪具有结构选择性和较强的药品区别能力，十分适用于对边境稽查中不断涌现的合成毒品类似物进行筛查。该仪器结构小巧，即使在空间有限的实验室或测试区域内也能较方便地安装使用，是违禁药品筛查推定实验中的有力工具。标准的样品制备、检测流程能够简化药物样品的核磁分析。根据同一类药品的结构相似性来归纳该类药品核磁谱图的特点，建立重点药品的核磁参考谱图数据库可加速案例样品的识别。 感谢AFP提供样品和测试实验室。感谢Dr. TristanRawling (UTS)， Mr. Adrian De Grazia (AFP)， Dr. Nata-sha Stojanovska (AFP)， Ms. Nikki Deery (AFP) 和Dr.Mark Tahtouh (AFP) 的支持和帮助。 上海皓鸿生物医药科技有限公司 上海皓鸿生物医药科技有限公司 Thermo scientificTM picoSpinTM 80 核磁共振波谱仪是一款价格合理、使用方便、结构紧凑的台式仪器。核磁共振谱图数据易于分析，能够反映出分子化学结构中的微小区别。药品分子中的关键官能团能够决定药品所属种类，例如苯丙胺类物质等，这些官能团使得每类药品有独特的核磁共振特征峰，可用于药品类别的区分。改变分子官能团的种类或者位置,会使其核磁共振谱图发生相应的不同变化，在特定的灵敏性条件下, 可依此对特定药品进行鉴别。使用 picoSpinTM 80 台式核磁共振波谱仪开发出一套标准操作程序（SOP），用于采集一系列苯丙胺衍生物和甲基苯丙胺衍生物的核磁谱图，建立谱图数据库。利用化学结构特征来区别不同物质种类，进行物质结构确认。然后根据谱图数据库来检测了几种已知和未知的案例样品。