食品中酶活性检测方案(紫外分光光度)

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紫外可见分光光度计检测食品中的酶活性 关键词：紫外可见分光光度计 美析仪器：UV-1800SPC 　　 酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。 　　为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。而紫外可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。下面我们来介绍用紫外可见分光光度计测定酶活的具体方法。 　　紫外可见分光光度法测定酶活性： 　　1. β半乳糖苷酶 　　一β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶（Lactase）。能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。 　　【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。 　　【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。 　　2. 超氧化物歧化酶 　　超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，简称SOD）是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次发现了SOD生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。 　　【酶活测定】在25℃ 4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma公司的SOD标准品，对所测样品SOD活性进行校正。 　　【酶活定义】在lml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个酶活单位， 即325nm 0.035OD/min为一个酶活单位。 　　3. 多酚氧化酶 　　多酚氧化酶（PPO）是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶，其作用机理在于铜的氧化-还原作用。大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后，具有单宁性质，易和蛋白质起交联作用而沉淀出来，进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大麦中部分PPO以“潜伏”状态存在，在浸麦过程中，可通过去除一些酶抑制剂、蛋白酶作用或其他的一些方式使其活性在浸麦过程中提高。在大麦发芽过程中，PPO的活力较高，影响着麦芽的质量。因此，在制麦过程中应该降低PPO活性。 　　【酶活测定】0.1mL酶液与lmL 0.1 mol/L邻苯二酚（用pH 8.4柠檬酸-磷酸缓冲液配制）80oC反应3min，用2mL 20%TCA终止反应，于波长450nm处用分光光度计测定吸收值。 　　【酶活定义】上述条件下，将每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活力单位。 　　4.葡萄糖氧化酶 　　上世纪60年代以前，葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工业，除去葡萄糖，防止发生Maillard反应，稳定产品质量，延长保质期。80年代末，又陆续开发了去除啤酒溶解氧和瓶颈氧改善风味延长保质期、果汁果酒除氧护色稳定质量、面粉品质改善、海产品和肉类保鲜、饲料添加去氧平衡畜禽胃肠代谢等用途，并建立了葡萄糖氧化酶专业生产车间。 　　【酶活测定】采用-联（二）茴香胺分光光度法。在有氧存在条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶（POD）作用下，氧供体即邻一联（二）茴香胺（DH2）被氧化成棕色产物。于436nm处测量吸光率的变化，即可换算为葡萄糖氧化酶的活性。 　　【酶活定义】一个酶活性单位定义为在26℃下每分催化释放一微克分子H2O2所需的酶量。 　　5. 果胶酶 　　果胶酶可以改善葡萄酒的色泽、增加酒香，并提高葡萄酒出汁率等，对提高红葡萄酒的品质有重要作用。 　　【酶活测定】向具塞试管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液（用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液配制，调节pH 10.0），于55℃水浴下保温5 min，然后加入一定稀释倍数的酶液0.2 mL反应15 min，加入DNS试剂1.5 mL，混匀，在沸水中加热10min，立即用自来水冷却，再加入21.5 mL蒸馏水，混匀，于分光光度计上520 nm测定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代替。 　　【酶活定义】在上述试验条件下，以每分钟分解底物产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活力单位。 　　6. 胰α-淀粉酶 　　【酶活测定】用移液管将0.5 mL酶溶液移入试管，并在水浴中调温至25℃。加0.5 mL已同样预热到25℃的1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS显色剂。置试管于沸水中5 min，冷却后用10 mL蒸馏水稀释。用分光光度计于540 nm处以空白作对照测定吸光度。以0.5 mL磷酸盐缓冲液代替酶液测定空白值。 　　7. 植酸酶 　　【酶活测定】 以植酸钠为底物，采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸钠（酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸钠缓冲液配制）1.0 ml，37 oC预热5 min后，准确加入适当稀释的酶液0.5 ml（对照组先加反应终止液），37 oC水浴反应30min后，再加入4 ml反应终止液（现用现配）冷却至室温，在415 nm处测定OD值，利用无机磷标准曲线计算出酶活。 　　【酶活定义】在37℃，每分钟从1 mmol/l植酸钠溶液中（用pH值5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制）释放出1 nmol无机磷所需要的酶量为一个酶活单位。 　　8. 羧甲基纤维素酶 　　【酶活测定】在0.5mL适当稀释的酶液中加入质量分数为0.625%的羧甲基纤维素钠溶液，于50℃水浴中保温30min，加2.0 mL质量分数为10%的NaOH溶液终止反应，再加入2.5mLDNS试剂，于沸水浴中煮沸15min，冷却，在550 nm波长处比色，要求光密度读数尽可能在标准曲线的0. 5 mg葡萄糖处。每次测定均设立空白对照，对照管先加入0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL质量分数为10%的NaOH溶液将酶灭活，再依次加入质量分数为0.625%的底物2. 0 mL，与待测管一起保温，加入DNS，煮沸、冷却、稀释比色、与标准曲线对照。 　　【酶活定义】在上述条件下，每30min产生0.5mg还原糖为1个Cx活力单位，即每1 h产生1.0mg还原糖为1个Cx活力单位。 　　9. 木聚糖酶 　　木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖（阿拉伯木聚糖），使其成为水溶性的，水解率达65%。面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能提高面团的持水性和机械强度，使面团具有更好的持气能力和操作耐力，进而提高馒头和面包的品质。 　　【酶活测定】以木聚糖为底物，用DNS法测定还原糖的生成量。取稀释酶液0.1ml，加1%木聚糖液0.9ml，置50℃水浴保温30min后，加DNS 2ml于沸水浴中显色3min，用自来水冷却后，加蒸馏水定容25ml，测O.D值。 　　【酶活定义】每毫升酶液每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所相当的酶量。 　　10. 蛋白酶 　　【测定原理】中性蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660 nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。 【酶活测定】取3支试管（一支空白管，两支样品管），分别向3支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0 mL，将3支试管放入40℃水浴中预热5 min，同时将测定底物（1%酪素）置同一温度水浴中预热5 min。分别向两只样品管中加入1%酪素溶液1.0 mL，准确计时，反应10 min取出。迅速准确向两只样品管加入0.4 mol/L三乙酸2mL，于空白管中加入0.4 mol/L三乙酸2 mL和1.0 mL 1%酪素溶液，摇匀。3支试管中反应液用滤纸过滤。另取3支试管，分别吸取上述相应滤出液1.0 mL，0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL和稀福林试剂1.0 mL，摇匀，置40℃水浴中放置20 min（显色），取出，迅速冷却置室温。以空白管调仪器零点，在分光光度计波长660 nm处分别测两支样品管吸光度，取平均值。通过查标准曲线求出生成酪氨酸的含量。 关键词：紫外可见分光光度计美析仪器：UV-1800SPC　　酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。　　为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。而紫外可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。下面我们来介绍用紫外可见分光光度计测定酶活的具体方法。　　紫外可见分光光度法测定酶活性：　　1. β半乳糖苷酶　　一β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶（Lactase）。能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。　　【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。　　【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。　　2. 超氧化物歧化酶　　超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，简称SOD）是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次发现了SOD生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。　　【酶活测定】在25℃ 4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma公司的SOD标准品，对所测样品SOD活性进行校正。　　【酶活定义】在lml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个酶活单位， 即325nm 0.035OD/min为一个酶活单位。　　3. 多酚氧化酶　　多酚氧化酶（PPO）是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶，其作用机理在于铜的氧化-还原作用。大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后，具有单宁性质，易和蛋白质起交联作用而沉淀出来，进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大麦中部分PPO以“潜伏”状态存在，在浸麦过程中，可通过去除一些酶抑制剂、蛋白酶作用或其他的一些方式使其活性在浸麦过程中提高。在大麦发芽过程中，PPO的活力较高，影响着麦芽的质量。因此，在制麦过程中应该降低PPO活性。　　【酶活测定】0.1mL酶液与lmL 0.1 mol/L邻苯二酚（用pH 8.4柠檬酸-磷酸缓冲液配制）80oC反应3min，用2mL 20%TCA终止反应，于波长450nm处用分光光度计测定吸收值。　　【酶活定义】上述条件下，将每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活力单位。　　4.葡萄糖氧化酶　　上世纪60年代以前，葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工业，除去葡萄糖，防止发生Maillard反应，稳定产品质量，延长保质期。80年代末，又陆续开发了去除啤酒溶解氧和瓶颈氧改善风味延长保质期、果汁果酒除氧护色稳定质量、面粉品质改善、海产品和肉类保鲜、饲料添加去氧平衡畜禽胃肠代谢等用途，并建立了葡萄糖氧化酶专业生产车间。　　【酶活测定】采用-联（二）茴香胺分光光度法。在有氧存在条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶（POD）作用下，氧供体即邻一联（二）茴香胺（DH2）被氧化成棕色产物。于436nm处测量吸光率的变化，即可换算为葡萄糖氧化酶的活性。　　【酶活定义】一个酶活性单位定义为在26℃下每分催化释放一微克分子H2O2所需的酶量。　　5. 果胶酶　　果胶酶可以改善葡萄酒的色泽、增加酒香，并提高葡萄酒出汁率等，对提高红葡萄酒的品质有重要作用。　　【酶活测定】向具塞试管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液（用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液配制，调节pH 10.0），于55℃水浴下保温5 min，然后加入一定稀释倍数的酶液0.2 mL反应15 min，加入DNS试剂1.5 mL，混匀，在沸水中加热10min，立即用自来水冷却，再加入21.5 mL蒸馏水，混匀，于分光光度计上520 nm测定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代替。　　【酶活定义】在上述试验条件下，以每分钟分解底物产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活力单位。　　6. 胰α-淀粉酶　　【酶活测定】用移液管将0.5 mL酶溶液移入试管，并在水浴中调温至25℃。加0.5 mL已同样预热到25℃的1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS显色剂。置试管于沸水中5 min，冷却后用10 mL蒸馏水稀释。用分光光度计于540 nm处以空白作对照测定吸光度。以0.5 mL磷酸盐缓冲液代替酶液测定空白值。　　7. 植酸酶　　【酶活测定】 以植酸钠为底物，采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸钠（酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸钠缓冲液配制）1.0 ml，37 oC预热5 min后，准确加入适当稀释的酶液0.5 ml（对照组先加反应终止液），37 oC水浴反应30min后，再加入4 ml反应终止液（现用现配）冷却至室温，在415 nm处测定OD值，利用无机磷标准曲线计算出酶活。　　【酶活定义】在37℃，每分钟从1 mmol/l植酸钠溶液中（用pH值5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制）释放出1 nmol无机磷所需要的酶量为一个酶活单位。　　8. 羧甲基纤维素酶　　【酶活测定】在0.5mL适当稀释的酶液中加入质量分数为0.625%的羧甲基纤维素钠溶液，于50℃水浴中保温30min，加2.0 mL质量分数为10%的NaOH溶液终止反应，再加入2.5mLDNS试剂，于沸水浴中煮沸15min，冷却，在550 nm波长处比色，要求光密度读数尽可能在标准曲线的0. 5 mg葡萄糖处。每次测定均设立空白对照，对照管先加入0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL质量分数为10%的NaOH溶液将酶灭活，再依次加入质量分数为0.625%的底物2. 0 mL，与待测管一起保温，加入DNS，煮沸、冷却、稀释比色、与标准曲线对照。　　【酶活定义】在上述条件下，每30min产生0.5mg还原糖为1个Cx活力单位，即每1 h产生1.0mg还原糖为1个Cx活力单位。　　9. 木聚糖酶　　木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖（阿拉伯木聚糖），使其成为水溶性的，水解率达65%。面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能提高面团的持水性和机械强度，使面团具有更好的持气能力和操作耐力，进而提高馒头和面包的品质。　　【酶活测定】以木聚糖为底物，用DNS法测定还原糖的生成量。取稀释酶液0.1ml，加1%木聚糖液0.9ml，置50℃水浴保温30min后，加DNS 2ml于沸水浴中显色3min，用自来水冷却后，加蒸馏水定容25ml，测O.D值。　　【酶活定义】每毫升酶液每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所相当的酶量。　　10. 蛋白酶　　【测定原理】中性蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660 nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。【酶活测定】1、取3支试管（一支空白管，两支样品管）2、分别向3支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0 mL3、将3支试管放入40℃水浴中预热5 min，同时将测定底物（1%酪素）置同一温度水浴中预热5 min。分别向两只样品管中加入1%酪素溶液1.0 mL4、准确计时，反应10 min取出5、迅速准确向两只样品管加入0.4 mol/L三乙酸2mL，于空白管中加入0.4 mol/L三乙酸2 mL和1.0 mL 1%酪素溶液，摇匀6、3支试管中反应液用滤纸过滤7、另取3支试管，分别吸取上述相应滤出液1.0 mL，0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL和稀福林试剂1.0 mL，摇匀，置40℃水浴中放置20 min（显色），取出，迅速冷却置室温。8、以空白管调仪器零点，在分光光度计波长660 nm处分别测两支样品管吸光度，取平均值。9、通过查标准曲线求出生成酪氨酸的含量。