胰凝乳蛋白酶原A中熔解温度检测方案(PCR)

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analytikjenaAn Endress+Hauser Company 通过 qPCR热漂移分析来检测蛋白熔解温度 蛋白质的稳定性取决于配体的相互作用、缓冲液条件或构象变化，传统上是通过麻烦费时的圆二色光谱(CD)来研究的。 其实有一种更为简单的检测方法，即基于温度诱导蛋白变性的热漂移分析，通过检测荧光染料 SYPROOrange 的信号强度变化来进行。 这种荧光染料是一种自然淬灭的染料，可与变性后暴露出来的蛋白质疏水核心相互作用。通过这种相互作用， SYPRO@ Orange染料释放出高强度的荧光信号。通过 qTOWER实时荧光定量 PCR 仪上的熔解曲线分析功能，可以轻松快速地确定蛋白的熔解温度，即所产生的解链曲线的中点或解链峰值对应下的温度，就是当前条件下蛋白的熔解温度(Tm值)。蛋白热漂移分析是检测蛋白质热稳定性的灵敏且快速的工具，有助于评估蛋白质配体结合的情况，从而找到最佳缓冲液条件或分析蛋白质变构情况。在本实验中，我们通过该方法测定了在三种不同 NaCl 浓度的 TBS中α-胰凝乳蛋白酶原A的Tm 值。 图1：SYPRO@ Orange 检测蛋白熔解曲线的原理 检测的仪器平台是：：qTOWER实时荧光定量 PCR 仪，含蛋白检测专用的SYPRO@ Orange 检测通道(490 nm/ 580 nm)。反应程序见表1. 每个反应一一三份，每份20ul(表2)。 另外，设计 NTC 作为质控参考(图2)。这种自然淬灭的染料与变性后暴露出的蛋白疏水核心相互作用，由水引发的猝灭作用衰减，可通过仪器实时检测到荧光信号的变化情况，并拟合成熔解曲线。将熔解曲线中最高峰对应的温度定义为熔解温度 Tm。如果 Tm值有变化，则表明蛋白的稳定性发生了变化，从而说明不同缓冲液体系对蛋白稳定性产生了不同作用。 表1：反应程序 Profile Temp. Holding Ramp. rate Equilibration 25℃ 10 sec max. Melting curve* 25-90℃ and 6 sec with AT=1℃ 表2：含1 mg/ml的a-胰凝乳蛋白酶原A的TBS 中的 NaCl 浓度不同 Component 20 mM NaCI 500 mM NaCI 2M NaCl o-Chymotrypsinogen A 1 pl 1 pl 1 pl TBS buffer 59 pl 59 pl 38 pl NaCl solution (5 M} - 7 pl 28 pl NaCl solution (0.2 M) 7 pl - SYPRO9 Orange 3 ul 3 pl 3 pl Final Volume 70 pl 70 ul 70 pl 图2：熔解曲线分析时的加样布局 检测结果： 图3和图4显示了α-胰凝乳蛋白酶原A的熔解曲线和相关分析。qTOWER配套的qPCRsoft分析软件自动完成了熔解曲线的拟合和结果显示。Tm值的变化表明不同NaCl 浓度对该蛋白的热稳定性有明显影响。 当NaCl浓度升高时，，α-胰凝乳蛋白酶原A的热稳定性也会升高。较高的盐浓度可使蛋白四周形成水包层，从而稳定了α-胰凝乳蛋白酶原A。因此，熔解温度 Tm 值大约升高了6℃。在20 mM NaCl 条件下 Tm 值约49℃，而在2MNaCl 条件下约为55℃(表3)。 图3：a-胰凝乳蛋白酶原A在不同NaCl 浓度下的熔解曲线原始图：20mM(灰色)，500 mM(黑色)和2M(红色) 图4：a-胰凝乳蛋白酶原A在不同NaCl浓度下的熔解曲线导数图；20 mM(灰色)，500mM(黑色)和2M(红色) 表33：α-胰凝乳蛋白酶原A的熔解曲线 Tm 值 NaCl Tm Mean Tm 20mM 49.1℃ 20mM 49.2℃ 49.1℃ 20mM 49.0℃ 500 mM 51.4℃ 500mM 51.1℃ 51.3℃ 500mM 51.4℃ 2M 51.4℃ 2M 51.6℃ 54.6℃ 2M 51.7℃ 结论： 与1个样品检测大概需要 1h的圆二色光谱方法相比，采用荧光定量PCR仪来开展此类实验，操作更加简单，用时更少(大约10min)，而且样品通量更多(一次可实现96或者384个样品的检测)，结果也清晰明了。需要提一下的是，不是所有荧光定量 PCR 仪都具有可以检测 SYPRO@ Orange 染料的检测通道，因此在开展此类实验之前，需要确认仪器的检测能力。耶拿公司的荧光定量 PCR 仪专门为此类研究提供了特定的检测通道，因此可以获得高质稳定的检测结果。 与1个样品检测大概需要1h的圆二色光谱方法相比，采用荧光定量PCR仪来开展此类实验，操作更加简单，用时更少（大约10min），而且样品通量更多（一次可实现96或者384个样品的检测），结果也清晰明了。需要提一下的是，不是所有荧光定量PCR仪都具有可以检测SYPRO® Orange染料的检测通道，因此在开展此类实验之前，需要确认仪器的检测能力。耶拿公司的荧光定量PCR仪专门为此类研究提供了特定的检测通道，因此可以获得高质稳定的检测结果。