牛奶中多种农药残留检测方案(气相色谱仪)

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应用简报 Agilent食品检测与农业 Trusted Answers 使用 Agilent Captiva EMR-Lipid 与LC/MS/MS 和 GC/MS/MS 对牛奶中的多种农药残留进行分析 本应用简报介绍了对牛奶中多类别多残留农药的分析。样品前处理方法基于 AgilentQuEChERS 萃取以及后续的 Agilent Captiva EMR-Lipid 净化和分析。使用两种仪器平台，分别是： Agilent 8890 气相色谱系统与 Agilent 7010B 三重四极杆质谱联用系统(GC/MS/MS) 和 Agilent 1290 Infinity II液相色谱系统与 Agilent 6470 三重四极杆质谱仪联用系统(LC/MS/MS)。 Captiva EMR-Lipid 可高效去除牛奶中的基质干扰，能够检测浓度低至 1 ng/mL的大多数农药。结果证明了该解决方案在牛奶多残留农药分析中的优势。对于研究的171种农药，98%的化合物的回收率在 60%-120%范围内，超过95%化合物的重现性≤10%RSD。 前言 牛奶是饮食中的一种重要食品，对婴儿和儿童而言尤其如此。牛奶中存在污染物是常见的食品安全问题，而整个乳制品行业在确保牛奶的安全性方面已经取得了很大进展。牛奶中的一种主要污染物类别是农药，其可能来源于动物摄入的受污染饲料或饮水 。牛奶中农药的最大残留限量通常远低于普通水果和蔬菜2。因此，分析牛奶中的农药要求样品前处理方法能够更好地去除基质，并要求分析仪器方法具有更高的灵敏度。本研究的目的是开发一种简单高效的工作流程，用于测定全球范围内牛奶中广泛受控的各种农药。 Captiva EMR-Lipid 是一款脂质去除产品，其将体积排阻与疏水相互作用两种净化机制相结合，能够选择性地捕获脂类烃链，同时不损失目标分析物。与传统 QuEChERS 分散净化相比， CaptivaEMR-Lipid 净化可提供简化的通过式工作流程以及高选择性和高效的脂质去除。在本应用简报中，使用简单的工作流程对171种农药及相关代谢物进行检测，其中首先进行 QuEChERS 萃取，然后进行 Captiva EMR-Lipid 净化，最后用LC/MS/MS 和 GC/MS/MS 进行分析。 化学品与试剂 所有试剂和溶剂均为 HPLC 或分析纯级。乙腈(ACN) 购自 Honeywell (Muskegon，MI， USA)。甲酸 (FA) 购自百灵威科技有限公司(中国北京)。农药及其代谢物标准品购自阿尔塔科技有限公司(中国天津)。 溶液与标准品 将溶于 ACN 中的单独或分组农药储备液(100 pg/mL)储存在-20℃下，然后用ACN配制混合加标溶液(1pg/mL)，并储存在-20℃下。配制 80/20 ACN/H，O洗脱溶剂，并将其储存于室温下。 ( 设备和消耗品 ) ( A gilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱，6mL， 600 mg (部件号5190-1004) ) ( Agilent Vac Elut 20 真空萃取装置， 带13×100mm 试管收集架(部件 号12234101) ) ( Agilent QuEChERS 萃取试剂盒， E N 15662方法，带50 mL 管和陶瓷均质子(部件号5982-5650CH) ) ( Agilent Bond Elut EMR-Lipid 反萃盐包，仅无水M g SO4(部件号5982- 0102) ) ( Agilent Bond Elut C18 萃取柱，500 mg， 6mL， 40 pm(部件号 12102052) ) ( Agilent QuEChERS 分散试剂盒，含 脂肪和蜡质的水果和蔬菜， AOAC 方 法 15mL(部件号5982-5158) ) SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder(Metuchen，NJ，USA) Eppendorf 5810R 离心机 (Hamburg，Germany) 液相色谱柱和气相色谱柱、衬管等 仪器条件 同时使用 LC/MS/MS 和GC/MS/MS 平台进行仪器检测。采用 Agilent 1290Infinity ll 液相色谱系统进行 LC/MS/MS检测。该系统包括 Agilent 1290 Infinity ll高速泵 (G7120A)、Agilent 1290 Infinity IIMultisampler (G7167B) 和 Agilent 1290Infinity ll高容量柱温箱 (G7116B)。将这些组件与配备安捷伦喷射流电喷雾离子源的6470A三重四极杆 LC/MS(G6470A)联用。采用 Agilent 8890 GC与 Agilent 7010三重四极杆 GC/MS进行 GC/MS/MS 检测。采用 AgilentMassHunter 工作站软件进行数据采集和分析。 表1列出了适合进行 GC 分析的农药的GC/MS/MS 方法参数；表2列出了适合进行 LC分析的农药的 LC/MS/MS 方法条件。 表1. GC/MS/MS 方法条件 GC/MS/MS参数 设置 色谱柱 Agilent HP-5ms UI， 30 mx0.25 mm，0.25pm (部件号19091S-433UI) 载气 氦气， 1.019 mL/min，恒流 进样量 1pL 进样口衬管 安捷伦超高惰性不分流单充衬管，带玻璃毛(部件号5190-2293) 柱温箱升温程序 60℃(1 min)， 以40℃/min升至120℃，然后以5℃/min 升至310℃ 进样口 分流/不分流；温度：280℃不分流模式， 0.75 min 时吹扫流速 30 mL/min 运行时间 40.5 min 传输线温度 280C 碰撞池 EPC 淬灭气体 He， 2.25mL/min；碰撞气体 N2， 1.5 mL/min 离子源温度 (HES) 280°℃ 四极杆温度 150°C 扫描类型 DMRM 增益因子 10 溶剂延迟 3 min MRM离子对和设置列于附录中。图1和 图2分别显示农药加标浓度为 50 ng/mL的牛奶样品的典型 GC/MS/MS MRM 色谱图和 LC/MS/MS 色谱图。 LC/MS/MS 参数 设置 色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse plus C18，3.0×150mm，1.8 pm (部件号959759-302) 柱温 45°C 自动进样器温度 10°C 进样量 2pL 流动相 A) 含4.5 mmol/L 甲酸铵、0.5 mmol/L 氟化铵和0.1%甲酸的水溶液B)含 4.5 mmol/L 甲酸铵、0.5 mmol/L 氟化铵和0.1%甲酸的甲醇溶液 梯度 时间(min) %B 流速(mL/min) 0 2 0.450.5 2 0.451 50 0.454 65 0.4516 100 0.4518 100 0.4518.1 2 0.45 20 2 0.45 停止时间 20 min 离子源参数 干燥气温度 250°℃ 气体流速 11 L/min 雾化器 40 psi 鞘气温度 350°C 鞘气流速 12 L/min 毛细管电压 +3500 喷嘴电压 +300 时间段 Agilent 1290 Infinity II二元系统 开始时间(min) 扫描类型 分流阀 Delta EMV(+) 0 DMRM 至废液 02.1 DMRM 至MS 400 18 DMRM 至废液 0 DMRM 至废液 x10 图1.加标牛奶样品中浓度为 50 ng/mL 的农药的 GC/MS/MS MRM 色谱图 样品前处理 牛奶购自当地超市，并使用本文所开发的样品前处理方法对牛奶样品进行前处理。图3给出分步程序，其中包括三个主要部分：使用 QuEChERS萃取试剂盒进行样品萃取，使用 Captiva EMR-Lipid 进行样品萃取物净化，以及使用专门用于 GC/MS/MS分析的无水 MgSO4盐析进行除水后处理。整个工作流程对原始样品浓度的稀释因子分别为3.125倍 (LC/MS/MS) 和2.5倍 (GC/MS/MS)。 校准标样和质量控制(QC)样品 将适量的标准加标溶液加入牛奶中并涡旋混合，然后平衡5分钟，得到预加标的QC样品。将标准溶液加入使用相同样品前处理工作流程处理的基质空白中，制得基质匹配校准标样。校准标样浓度相当于牛奶中浓度为1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL。根据校准曲线对四种浓度的牛奶 QC 样品进行定量分析，这四种浓度分别为低浓度(5 ng/mL 和/或 10 ng/mL)、中等浓度(50 ng/mL) 和高浓度(100 ng/mL)， 各重复分析四次。由保留时间和 MRM 离子对确定分析物鉴定、确认和定量结果。 图2.加标牛奶样品中浓度为 50 ng/mL 的农药的 LC/MS/MS MRM 色谱图 样品萃取和基质去除研究 对5mL牛奶样品的萃取方法进行评估。首先，对15mL ACN 溶剂萃取与 QuEChERS萃取又剂盒(使用10mL ACN， 然后进行QuEChERS EN 萃取)进行比较。另外，对净化步骤也进行了评估。对未经净化的样品萃取物与使用以下净化技术得到的样品萃取物的 GC/MS 全扫背景曲线进行比较： Captiva EMR-Lipid 净化、 Bond ElutC18 SPE 净化和 Bond Elut QuEChERSdSPE 净化。 样品前处理优化 对两种萃取方法进行评估：使用ACN的溶剂萃取和使用 ACN 的 QuEChERS 萃取。据报道，酸化 ACN 可能导致某些农药(如双甲脒和单甲脒)降解，因此使用非酸化 ACNB。对于许多疏水性农药，采用 QuEChERS 萃取得到的回收率优于单独使用 ACN 萃取所得到的结果。因此，最终选择 QuEChERS 萃取方法进行牛奶样品的萃取。 通过对未经净化的样品萃取物与使用Captiva EMR-Lipid、Bond Elut C18 萃取柱和 QuEChERS dSPE 试剂盒等净化技术得到的样品萃取物的 GC/MS 全扫描背景曲线进行比较，对基质去除率进行研究。叠加的全扫描色谱图如图4所示。比较整个保留时间窗口内的总积分峰面积， 证明 Captiva EMR-Lipid 净化技术可去除99%的基质，且明显优于其他三种净化方法。使用Captiva EMR-Lipid 进行净化，还可以去除较晚洗脱的干扰物质(如30分钟后所示)，这些干扰物质是造成仪器污染的重要原因。 行比较，结果如图5所示。结果表明，由于在分散试剂盒中使用碱性吸附剂PSA， 因此 QuEChERS 分散 SPE 净化导致酸性农药产生大量损失。 随后研究了 Captiva EMR-Lipid 萃取柱净化步骤的回收率，对通过两个连续洗脱 对使用各种净化技术得到的农药回收率进 图4.使用不同净化方法得到的牛奶样品的 GC/MS全扫描结果 QuEChERS 净化 Agilent Captiva EMR-Lipid 净化 图 5.在 LC/MS/MS分析中， 使用 Agilent QuEChERS dSPE 净化和 Agilent Captiva EMR-Lipid 净化得到的加标浓度为 40 ng/mL的酸性农药的回收率的比较 步骤洗脱的总量进行测定。在图6所示的经过和不经二次洗脱所得到的回收率数据的箱线图中，方框的中线表示回收率中值，方框底部和顶部的线分别代表下半回收率值和上半回收率值的中值。箱线(垂直线)从方框的两端延伸至最小值和最大值。总体而言，二次洗脱可明显提高农药的回收率。因此，在经过初始6mL样品混合物洗脱后，应用1.5 mL 80/20ACN/水进行二次洗脱。 引入残留的水可能会影响气相色谱仪，因此必须除去 Captiva EMR-Lipid 净化后洗脱液中的水。在以前发表的解决方案中，曾采用各种方法在 GC/MS/MS分析前进行除水[4.5。对于分析物具有各种不同的化学物理特性的大范围农药分析，通常建议使用 MgSO4盐析，该方法已被证明是合适的除水方法。 方法验证 GC/MS/MS 和 LC/MS/MS 的定量方法验证包括校准曲线线性、分析物回收率和四个加标水平下的精密度。详细定量结果列于表3和表4中，统计汇总结果如图7所示。超过98%的分析物获得了可接受的回收率(60%至120%)，超过95%的分析物的 RSD 值小于10%。在171种农药中，43种农药通过 GC/MS/MS 和LC/MS/MS平台检测进行了双重验证。 图6.在 LC/MS/MS 和 GC/MS/MS分析中，在经过和不经二次洗脱的条件下得到的牛奶中加标浓度为 40 ppb的农药总体回收率的比较 图7.牛奶方法验证中农药分析的统计汇总结果 表 3.使用 GC/MS/MS得到的牛奶中118种农药的方法定量分析结果 *使用两种仪器平台 (GC/MS/MS和 LC/MS/MS) 对农药进行验证 表 4.使用 LC/MS/MS 得到的牛奶中95种农药的方法定量分析结果 名称 线性范围 (ng/mL) R² 牛奶中浓度为 5ng/mL 的 低浓度 QC (n=4) 牛奶中浓度为10 ng/mL 的低浓度 QC (n=4) 牛奶中浓度为 50 ng/mL 的中等浓度 QC(n=4) 牛奶中浓度为 100 ng/mL 的高浓度QC(n=4) 平均回收率(%) RSD% 平均回收率 (%) RSD% 平均回收率 (%) RSD% 平均回收率(%) RSD% 螺虫乙酯 1-500 0.994 91.7 7.0 107.9 4.1 112.3 3.7 112.2 3.2 螺虫乙酯代谢物 BYI08330-顺式丁烯醇 1-200 1.000 95.9 5.6 100.6 3.2 109.2 0.9 109.5 0.6 氟啶虫胺腈* 1-500 0.998 100.2 5.2 105.5 3.9 112.0 0.7 113.4 1.0 虫酰肼 1-500 0.998 102.4 8.4 109.3 5.9 116.2 6.2 115.3 1.9 特丁硫磷砜* 1-500 1.000 90.5 3.0 95.9 0.9 102.4 2.3 106.6 1.1 特丁硫磷亚砜 1-500 0.993 95.4 6.9 100.8 2.5 107.8 1.6 113.6 0.3 噻菌灵* 1-500 0.996 96.0 6.7 104.6 4.9 112.8 1.4 113.1 2.3 噻虫啉 1-200 1.000 97.9 5.5 101.1 4.0 105.6 1.2 109.0 1.5 噻虫嗪 1-200 0.999 99.8 6.4 108.7 3.6 116.1 0.9 117.9 1.7 三唑酮* 1-200 0.999 96.6 2.3 102.9 3.4 109.8 1.5 108.3 0.7 三唑醇 1-500 0.999 99.9 7.0 104.4 3.0 108.2 0.6 108.0 1.2 嗪氨灵 1-200 0.999 92.7 5.2 102.9 3.8 114.6 2.4 112.6 1.3 *使用两种仪器平台 (GC/MS/MS和 LC/MS/MS) 对农药进行验证 开发并验证了一种采用 QuEChERS 萃取和 Agilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱净化并通过 LC/MS/MS 和 GC/MS/MS分析牛奶中的171种农药多残留物的快速、可靠且稳定的工作流程。考察了样品前处理程序，并对萃取方法、基质去除、洗脱效率和除水进行了优化。 Captiva EMR-Lipid净化可提供最出色的基质去除效率和最少的仪器污染。整个工作流程可提供令人满意的定量结果，并展示了一种用于分析牛奶中多类别多残留农药的高效解决方案。 ( 参考文献 ) ( 1. . Abou Donia， M . A . et al. ChemicalComposition of Raw Milk a nd the Accumulation of Pesticide Residuesin Milk Products. Global V eterinaria 2010，4(1)，6 ) ( 2. GB 2763-2019食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量： https：//www.codeofchina.com/ standard/GB2763-2019.html ) ( 3. Yang，X.， A nalysis of Formamidine Pesticides and Metabolites in Pork and Porcine Liver Using AgilentCaptiva EMR-Lipid and LC/MS/MS(使用 Agilent Captiva EMR-Lipid 和 LC/MS/MS分析猪肉以及猪肝中 的甲脒农药及其代谢物)，安捷伦 科技公司应用简报，出版号5994- 0357EN，2019 ) 4. Zhao，L.， Determination of Multiclass， Multiresidue Pesticides in Olive Oils by Captiva EMR-Lipid Cleanup and GC/MS/MS (利用 Captiva EMR-Lipid 净化和 GC/MS/MS 对橄榄油中的多类别多残留农药进行 测定)，安捷伦科技公司应用简报， 出版号 5994-0405EN，2018 GC/MS/MS 和 LC/MS/MS 的 MRM 参数设置 化合物名称 GC/MS/MS MRM 设置 RT (min) 定量离子对 定性离子对 丙溴磷 23.30 207.9->63.0 338.8->268.7 敌裨 17.70 161.0->99.0 161.0->90.0 丙环唑1 26.16 172.9->145.0 172.9->74.0 丙硫磷 23.19 266.9->239.0 308.9->238.9 唑菌胺酯 35.18 132.0->104.0 132.0->77.1 嘧霉胺 16.15 198.0->118.1 198.0->183.1 吡丙醚 29.61 136.1->78.1 136.1->96.0 喹硫磷 21.63 146.0->118.0 146.0->91.0 喹氧灵 26.03 271.9->237.1 237.0->208.1 皮蝇磷 18.64 285.0->269.9 286.9->272.0 螺螨酯 31.55 109.1->81.1 109.1->79.1 氟啶虫胺腈 12.70 173.7->104.1 173.7->154.0 特丁磷 15.86 230.9->175.0 230.9->129.0 特丁硫磷砜 21.22 153.0->97.0 198.9 ->96.9 四氯杀螨砜 29.02 158.9->131.0 226.9->199.0 噻菌灵 21.22 201.0->174.0 201.9->175.0 三唑酮 20.10 208.0->181.1 208.0->111.0 三唑磷 25.64 161.2->134.2 161.2->106.1 化合物名称 LC/MS/MS MRM 设置 RT (min) 母离子 子离子 碎裂电压 碰撞能量 极性 2，4-D 5.79 219.0 161.0 90 15 - 221.0 163.0 15 2-氯苯甲酸 4.19 155.0 111.0 65 4 一 155.0 35.1 10 3，6-二氯苯甲酸 4.03 204.9 160.9 80 10 204.9 125.0 22 4-羟基百菌清 4.89 244.9 181.9 146 34 244.9 174.9 30 啶虫脒 3.60 223.0 126.1 80 18 一 223.0 99.0 44 涕灭威 4.52 208.0 116.0 65 6 + 208.0 89.1 10 涕灭威砜 2.92 223.1 86.1 80 8 + 223.1 76.0 0 涕灭威亚砜 2.85 207.1 131.9 65 2 + 207.1 105.2 4 氯氨吡啶酸 2.77 207.0 161.0 90 20 + 207.0 134.0 32 双甲脒 14.30 294.2 163.0 90 12 + 294.2 122.0 32 嘧菌酯 7.11 404.0 372.2 105 10 + 404.0 344.0 24 苯达松 4.66 239.0 197.0 105 17 239.0 132.0 25 ( 查找当地的安捷伦客户中心： ) www.agilent.com/chem/contactus-cn www.agilent.com ( 免费专线： 800-820-3278，400-820-32 7 8(手机用户) ) DE.4167708333 联系我们： 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 LSCA-China_800@agilent.com ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，20202020年6月24日，中国出版 ) 在线询价： 5994-2038ZHCN www.agilent.com/chem/erfq-cn 本应用介绍了对牛奶中多类别多残留农药的分析。样品前处理方法基于 Agilent QuEChERS 萃取以及后续的 Agilent Captiva EMR-Lipid 净化和分析。使用两种仪器平台，分别是：Agilent 8890 气相色谱系统与 Agilent 7010B 三重四极杆质谱联用系统( GC/MS/MS) 和 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统与 Agilent 6470 三重四极杆质谱仪联用系统 (LC/MS/MS)。Captiva EMR-Lipid 可高效去除牛奶中的基质干扰，能够检测浓度低至 1 ng/mL 的大多数农药。结果证明了该解决方案在牛奶多残留农药分析中的优势。对于研究的 171 种农药，98% 的化合物的回收率在 60%–120% 范围内，超过 95% 化合物的重现性 ≤ 10% RSD。