植物中诱变育种检测方案(诱变育种仪)

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清华大学无锡应用技术研究院生物育种研究中心天木生物 什么是等离子体? www.biobreeding.comWww.tmaxtree.com ARTP诱变案例一植物 _天木生物 无锡源清(洛阳华清)天木生物科技有限公司成立于2014年，是清华大学无锡应用技术研究院院属孵化企业，是专业的生物育种装备制造商和生物产业技术服务提供商。 ARTP 生物育装装备及其平台建设 ·成功研制出国际首套集成化的ARTP育种装备，操作简便、快速，安全性高； ·成功应用于百余种微生物和动植物的诱变育种 ·设备服务大专院校、科研机构和重要企业百余家；出口日本、新加坡等 获得第45届日内瓦国际发明展金奖，通过轻工联合会技术鉴定 ·参与国家重点研发计划“七大作物育种”专项，主持“国家质量基础”专项微生物育种国家标准制定课题 ARTP IIS ARTP IIIS ARTP M 技术及装备孵化转化平台 ICES，Singapore Kobe U， Japan 清华大学无锡应用技术研究院生物育种研究中心 洛阳天木生物工程技术研究院 >> 诱变育种仪(植物型) 定义： ● 特点： 导电流体； 化学性质活泼； 产生方式： plasma 发光特性。 高温(自然界广泛存在)放电(人工常见) 常压室温等离子体 ARTP 细胞膜 细胞 SOS响应被激发状态 (1)紫外线损伤的修复基因uvrA， uvrB、uvrO(分别编码切除酶的亚基)； DNADNA损伤激发信号RecA辅蛋白酶激活LexA阻遏物分解一系列SOS基因表达 OOOOOOOO (2)LexA基因本身； (3)编码单链结合蛋白的基因ssb， 与 噬菌体DNA整合有关的基因himA； (4)与诱变作用有关的基因umuDC(编 umuC Mww 码DNA聚合酶V)和dinB(编码DNA聚· wow www 合酶Ⅳ)； C 容错性修复 (5)与细胞分裂有关的基因sulA、ruv lex4 rex4 诱导基因 和lon 微生物存活 信号物质浓 SOS响应未被激发状态 度下降 00 XOO 错配稳定遗传 阻遏物积累 LexA阻遏物结合 阻遏物结合 突变株 lexA rexA 诱导基因 (1)ARTP产生的等离子体中富含各种化学活性粒子； (2)活性粒子可以对菌株/植物细胞产生多重作用，如造成遗传物质的损伤、引起细胞膜通透性和蛋白结构的改变等； (3)活性粒子对DNA物质的作用，可以引起DNA结构的多样性损伤； (4)细胞启动SOS修复机制， SOS修复为一种高容错率修复，在修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株； (5)经过后期筛选可以得到性状优良的突变株； (6)生产效率与经济效益大幅提高。 ARTP的特点与优势 条件温和、可控性强 活性粒子多样、丰富 损伤强度高，突变率高 诱变效果显著 方法 安全性 使用便捷性 应用广谱性 使用效果 应用成本低 化学诱变 + + + +++ 常规物理诱变 + ++ ++ + +++ 离子束注入 + 一 +++ + ARTP +++ +++ +++ +++ +++ 截止至2021年底，岁发表相关论文、专利等共计868篇c 植物界 真菌界 動物界 Plantae Fungi Animalia >50 kinds of microbes 原生動物 原生動物界 Protozoa Protista 細菌 ·原核生物界 恐0S Bacteria Monera (a) ARTP发表文章案例分类图 ARTP逐年案例数量 案例一：ARTP诱变育种技术在玉米育种中的应用 ARTP 处理对玉米花粉萌发率的影响(A：不同处理时间下玉米花粉萌发率；B，C：玉米花粉体外萌发，B为ARTP处理0 s； C为ARTP处理360 s；D： ARTP处理的花粉授粉后结实情况) ( [3]骆美洁，赵衍新，宋伟等，常压室温等离子体对玉米种子计划分萌发的影响，分子植物育种， 2016，14[5]，1262-1267。 ) ARTP处理玉米种子，其幼苗随着处理时间的延长，干重逐渐增加；当ARTP处理30min 幼苗显著增长，而幼苗根长/苗高比值降低。 ARTP对玉米花粉处理，随着处理时间的增加，花粉萌发率大幅度降低，处理360s时，花粉萌发率接近为零。 案例二：ARTP诱变育种技术在玉米育种中的应用 用ARTP处理玉米萌动种子，从M1代中发现矮秆、分蘖和雄性不育的玉米突变。其中，矮化株系连续三代性状稳定；对这一矮秆突变株系与其亲本基因组DNA重测序表明，按基因组全部碱基对计算，突变率0.083%，高于化学诱变突变率。基因组重测序和转录组测序表明， ARTP对植物基因组DNA序列有较高的诱变率。 玉米矮秆突变体M2代基因组重测序分析 SNP Indel 1，521，478 bp 223，238 bp 突变率0.083% 未突变2，104，593，401 bp 编码序列 启动子序列 54，149 bp (3.10%) 132，500 bp(7.59%) 基因间序列 1，382，375 bp (79.23%) 案例三：ARTP诱变处理小麦的生物效应 ·ARTP-400W处理能够引起当代种子发芽势、发芽率、苗高、幼苗根长的变异，，显著； ARTP处理萌动种子和愈伤组织时能使萌动种子M1代幼苗形成半致矮效应， 引起萌动种子和愈伤组织M1代基因组的结构变异；破坏愈伤组织细胞膜和细胞器结构与功能； 使萌动种子M1代植株株高、穗长、有效穗、穗粒数显著降低。 ARTP 处理小麦干种子、萌动种子及幼胚后，M2代群体中均出现了突变植株，产生突变的性状包括株高、分蘖数、穗形、叶色，其中有的突变植株抽穗期推迟。 其中株高增加和叶片颜色变浅的突变植株，同等条件下γ射线处理的 M2 代群体中不存在这类突变植株。 综上， ARTP 处理应用于小麦诱变具有可行性。 测序结果表明， ARTP处理后M代基因组SNP数目与SNP杂合率低于对照，随着处理时间与剂量的增加， SNP数目与杂合率上升，，能引起 G/C碱基突变成 A/T碱基，使得DNA中 G/C碱基含量降降，这在敏感型与钝感型材料中的表现一致，ARTP诱变可以引起基因组单核苷酸变异。 ARTP可以引起基因组结构的变异(推测发生变异的 SNP 影响控制幼苗株高、根长增长的基因) 案例四：ARTP诱变育种技术在昆仑雪菊育种中的应用 经过ARTP辐照雪菊种子后，花径大小普遍增加，基部红褐色部分大小增加，产生了花型花色的变异，部分有效活性成分的增加。 ARTP辐照对昆仑雪菊'花形影响的形态图 注：： Tm：多瓣化的变异植株； Ts：雄蕊瓣化的变异植株；； Tt：管状化的变异植株。 ARTP对怀牛膝种子的诱变效应 (1)种子萌发： ARTP处理可以提高怀牛膝种子的发芽势和萌发率，但长时间的ARTP辐照反而降低种子的萌发效率，辐照22.5分钟的种子的发芽势和萌发率均达到最大值，分别为83.3%和90%。 (2)形态：一定时间的ARTP辐照促进了怀牛膝的生长，与对照相比，株高、最大冠幅、最大叶长、最大叶宽均有所增加。 (3)产量： ARTP的辐照可以提高怀牛膝的产量。所有处理的单株干重均大于对照株系，单株最大根粗、根长、分根数、单株根鲜重和干重均增加。(4)品质： ARTP辐照均可显著地提高怀牛膝有效药用成分β-蜕皮甾酮的含量。 图1：ARTP变变对怀牛膝幼苗生长的影响 A B 图3：ARTP辐照对怀牛膝根的影响 甘蓝型油菜花粉粒 ARTP诱变及后代表型鉴定 (1)种子萌发： CK、ARTP20、ARTP30 和 ARTP40诱变花粉授粉所得MO代子粒发芽势分别为 96.00%±1.00%、37.00%±2.65%、0.00%±0.00%与13.67%±2.52%： 发芽率分别为100%±0.00%、73.67%±3.79%、12.33%±3.06%与27.67%±2.52%，，7表明 ARTP 辐照显著影响MO代子粒的发芽势与发芽率。 (2)立量：现ARTP30 M1代子粒含油量较 CK有显著提升(43份子粒含油量超过50.2%，占比13.69%)， 其中 ARTP30-315 单株子粒含油量最高，达52.61%，，较CK 含油量均值增幅 27.11%。 图1M0代子粒发芽势与发芽率 图2M0代植株不育株率统计 ( 云南省农业科学院俎峰老师研究团队 ) 案例七：ARTP对直立型扁蓿豆生长特性的影响 100 ARTP对立型型扁蓿豆生长特性的影响 (1)种子萌发：处理时间延长至30min时，不仅增加了其幼苗高度、节间长、新生叶等生长速度，并显著增加了其产量及其相关指标，，说明ARTP处理合适的时间可有效促进扁蓿豆生长。 (2)形态：：：处理30min的3个部位叶面积较对照显著增大了0.61~1.04倍(P<0.05)，处理10min茎端新叶和茎中部叶面积显著大于对照(P<0.05)0 图1M0代子粒发芽势与发芽率 图2M0代植株不育株率统计 内蒙古农业大学石凤翎老师研究团队 ARTP诱变育种技术在农作物育种中的应用 (种子、花粉) (愈伤组织) (打磨表皮后的种子) 怀山药(组织培养) 在研项目还包括：两色金鸡菊、胡麻、二二月兰等。 ARTP植物育种部分应用案例 植物相关研究 序号 单位 种类 效果 1 四川农业大学 玉米种子 发现矮秆、分蘖和雄性不育的玉米突变，基因组DNA重测序表明，按基因组全部碱基对计算，突变率0.083%，高于化学诱变突变率。 2 北京市农林科学院玉米研究中心 玉米种子 常压室温等离子体对玉米种子及花粉萌发的影响 3 山东省蚕业研究所 二月兰种子 常压室温等离子体对NaCl胁迫下胡麻种子萌发及幼苗生理特性的影响 4 山东省蚕业研究所 胡麻种子 常压室温等离子体对NaCl胁迫下胡麻种子萌发及幼苗生理特性的影响 5 河南师范大学 两色金鸡菊 产生了花型花色的变异，部分有效活性成分的增加 6 河南师范大学 怀牛膝 促进了怀牛膝的生长，提高了怀牛膝的产量，提高怀牛膝有效药用成分β-蜕皮甾酮的含量。 7 洛阳师范大学 枣树枝条 进行中 ARTP-Awww.biobreeding.com www.tmaxtree.com 长江大学硕士学位论文指导老师刘录祥研究员徐延浩教授 ARTP 生物育种装备及其平台建设成功研制出国际首套集成化的ARTP育种装备,操作简便、快速，安全性高；成功应用于百余种微生物和动植物的诱变育种设备服务大专院校、科研机构和重要企业百余家；出口日本、新加坡等获得第45届日内瓦国际发明展金奖，通过轻工联合会技术鉴定参与国家重点研发计划“七大作物育种”专项，主持“国家质量基础” 专项微生物育种国家标准制定课题什么是等离子体？定义：等离子体（Plasma）是与物质的固态、液态和气态并存的物质第四态（1879,英,W. Crooks），是一种正离子和电子的密度大致相等的电离气体。(1928,美, I. Langmuir)特点：1.分布广2.导电流体；3.化学性质活泼；4.发光特性。 ARTP作用机理（1）ARTP产生的等离子体中富含各种化学活性粒子；（2）活性粒子可以对菌株/植物细胞产生多重作用，如造成遗传物质的损伤、引起细胞膜通透性和蛋白结构的改变等；（3）活性粒子对DNA物质的作用，可以引起DNA结构的多样性损伤；（4）细胞启动SOS修复机制，SOS修复为一种高容错率修复，在修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株；（5）经过后期筛选可以得到性状优良的突变株；（6）生产效率与经济效益大幅提高。ARTP的特点与优势1、条件温和、可控性强2、活性粒子多样、丰富3、损伤强度高，突变率高4、诱变效果显著 截止到2022年07月25日，中文文献402篇，英文文献165篇，专利202篇，学位论文165篇，共计934篇。