采用代谢物鉴定软件根据 Q-TOF MS 和 MS/MS 数据进行代谢 物结构解析

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免疫抑制类药物包含类似雷帕霉素（西罗 莫司）、依维莫司和他克莫司（图 1）等具 有高度复杂结构的大环化合物。确定它们 的代谢物并分析其毒理学安全性对于这些 药物的使用是至关重要的。对于主要体外代 谢产物的快速鉴定，ESI LC/MS 与 MS/MS 联用是首选的工具。这一点已经通过雷帕 霉素的羟基化和去甲基化代谢产物的鉴定 得到了证明1。更多有关该化合物的代谢 研究揭示了来自水解开环反应2 和环氧化 反应3 的代谢产物。此外，在一项对比代 谢研究中还描述了不同生物体内的代谢4。 鉴定出代谢产物后的下一步是解析其结 构。串联质谱法可通过 MS/MS 实验鉴别 分子结构的不同部分。采用 Q-TOF 质谱仪 进行 MS 和 MS/MS 精确质量数测定，意 味着可以计算得到 MS/MS 碎片的分子式 以支持结构解析5。本应用简报介绍了依据来自体外代谢实验 的精确质量数 Q-TOF 数据，通过 MetID 软 件辅助鉴定雷帕霉素的代谢物。采用 MetID 软件依据精确的 MS 和 MS/MS 数据计算 出了离子碎片的化学式及生物转化修饰的 信息，以用于结构解析。计算机辅助复杂药物及其代谢物的结构解析 采用代谢物鉴定软件根据 Q-TOF MS 和 MS/MS 数据进行代谢物结构解析 应用简报 作者 Uwe Christians， Rene KupferbioNovo， 12635 East Montview Blvd.，Aurora， Colorado， CO，USA. Edgar Naegele 安捷伦科技 德国 Waldbronn 摘要 本应用简报介绍了： ·将 Agilent 1200 系列快速分离LC系统与 Agilent 6520 精确质量 Q-TOF联用进行药物代谢实验中的数据采集 ·利用代谢物鉴定软件进行复杂药物分子代谢物的鉴定 ·利用代谢物鉴定软件中提供的工具进行复杂代谢物分子的结构解析 引言 免疫抑制类药物包含类似雷帕霉素(西罗：莫司)、依维莫司和他克莫司(图1)等具有高度复杂结构的大环化合物。确定它们的代谢物并分析其毒理学安全性对于这些药物的使用是至关重要的。对于主要体外代谢产物的快速鉴定， ESI LC/MS 与MS/MS联用是首选的工具。这一点已经通过雷帕霉素的羟基化和去甲基化代谢产物的鉴定得到了证明1。更多有关该化合物的代谢研究揭示了来自水解开环反应2和环氧化反应3的代谢产物。此外，在一项对比代谢研究中还描述了不同生物体内的代谢4。 鉴定出代谢产物后的下一步是解析其结构。串联质谱法可通过 MS/MS 实验鉴别分子结构的不同部分。采用 Q-TOF 质谱仪进行 MS 和 MS/MS精确质量数测定，意味着可以计算得到 MS/MS碎片的分子式以支持结构解析5。 本应用简报介绍了依据来自体外代谢实验的精确质量数 Q-TOF数据， 通过 MetID软件辅助鉴定雷帕霉素的代谢物。采用 MetlD软件依据精确的 MS 和 MS/MS 数据计算出了离子碎片的化学式及生物转化修饰的信息，以用于结构解析。 实验部分 ·Agilent 1200 系列快速高分离度液相色谱系统， 配有 Agilent 1200 系列二元泵 SL和 Agilent 1200 系列脱气机；带控温系统的 Agilent 1200 系列高性能自动进样器SL (ALS SL) ； Agilent 1200 系列柱温箱(TCC) ·Agilent 6520 精确质量 QTOF质谱仪 ( ·色谱柱：采用 Zorbax SB-C18柱， 2.1x150mm， 1.8um粒径 ) 样品制备 储备液： 磷酸盐缓冲液： 100mM， pH 7.4； 5 mM MgCI，雷帕霉素： 1 mg/mL 的磷酸盐缓冲液溶液NADPH 溶液： 10 mg/mL 的磷酸盐缓冲液溶液大鼠肝微粒 体制备液： 20 mg 蛋白/mL 代谢物样品： 在1.5 mL 离心管中加入180pL磷酸盐缓冲液和25pL雷帕霉素溶液。加入15uL的肝微粒体制备液和30pL的NADPH溶液。涡旋并在37℃下孵育1小时。加750pL冰乙腈终止反应， 14000 rpm 离心 15分钟。将上清液移入一个新的 1.5 mL 离心管，在 speedvac 真空离心浓缩仪中蒸干。将固体物质用 250 pL HPLC 流动相A复溶。 图1 大环类免疫抑制剂雷帕霉素(西罗莫司)、依维莫司和他克莫司的结构。 对照样品 在 1.5 mL离心管中加入210pL磷酸盐缓冲液和 25 pL 雷帕霉素溶液。加入15pL的肝微粒体制备液。涡旋并在37℃下孵育1小时。加750pL 冰乙腈终止反应，14000 rpm 离心 15分钟。将上清液移入一个新的1.5mL离心管， 在 speedvac 真空离心浓缩仪中蒸干。将固体物质用250pLHPLC 流动相A复溶。 实验方法： 高分离度快速液相色谱法 Agilent 1200 系列二元泵 SL 的运行条件：溶剂A： 水+0.1%(v/v)甲酸， 溶剂B： 乙腈+0.1%(v/v)甲酸流速： 0.5 mL/min梯度： 0 min 5%B，0.5 min 5 %B，20 min 95%B，22 min 95 %B 停止时间： 22分钟 后运行时间：10分钟 使用 Agilent 1200 系列自动进样器 SL 进样10pL。针头用 50%的甲醇洗针5秒，样品冷却到4°℃。柱温箱为60°℃。 QTOF MS 和MS/MS 方法 Agilent 6520 精确质量 QTOF 采用 2GHz 扩展动态范围模式，采集参数如下：离子源： 带参比离子(m/z 121.05087 和m/z922.00979) 溶液双喷雾的正离子模式 ESI 源干燥气流量： 10.0L/min干燥气温度：300℃雾化器： 45 psi扫描范围： 100-1000碎裂电压： 200V锥孔电压： 60V毛细管电压：3500V碰撞能： 50V数据依赖 MS/MS： 2化合物， 3MS/MS光谱，排除0.1分钟 MetID 软件中的数据分析方法 数据分析的第一步为含代谢物(代谢物样品)的 MS 谱图和仅含母体药物(对照样品)的 MS 谱图的比较。利用分子特征提取(MFE) 算法从质谱级数据中提取出所有检测到的质量数信号。然后将相关的化合物同位素质量数和加合物质量数归类成一个个的分子特征，并去除化学背景噪音。接下来将代谢物样品的化合物列表与对照 样品的化合物列表进行比较。将代谢物样品中新出现的或响应增加了至少两倍的化合物视作可能的代谢物，并由用户指定以不同算法对它们进行进一步分析。这些算法既可以鉴定和确认新化合物，也可以仅确认其他算法发现的代谢物。最后对所有代谢物鉴定算法的结果加权，并综合所有结果确定最终的鉴定相关性得分。当代谢物的最终得分高于一个事先定义的相关性阈值时，该代谢物将被确认。所有算法的结果可总结在一个结果表里，便于快速查阅6。 结果与讨论 雷帕霉素体外代谢实验的 Q-TOF 数据经MetID 软件处理并结合软件中各种算法的结果，共鉴定出了7个代谢产物(图2)。典型的代谢物均来自羟基化和去甲基化反应，所有化合物的典型载荷子为钠原子。最终，代谢物的结构解析完成后便开始进行代谢物的鉴定工作。该工作是由 MetID软件采用碎片离子图谱匹配算法辅助完成的。该结果可直接用于结构解析。 根据对应加钠峰 m/z 936.5430， 可以在质谱图中提取出 15.60分钟洗脱的母体化合物雷帕霉素1的峰(图3)。根据该加钠化合物离子的化学式 C51H7gNNa013， 可计算得到 m/z 913.5538 处的分子式为C51H7gNO13(相对质量偏差为1.44 ppm)。该计算中不仅考虑了准确质量数，还将完整的同位素分布同计算的分布进行了匹配。(表1)。 为进行代谢产物的详细结构解析，比较了母体药物雷帕霉素和代谢物的 MS/MS谱。出于此目的，采集了雷帕霉素1的MS/MS谱(图4)。在该 MS/MS 谱上可以看到母体药物雷帕霉素1丰富的碎片离子，分布在整个质量范围。所有的碎片 图3 雷帕霉素1的质谱、加钠峰和加钾峰的同位素分布。加钠峰的计算同位素分布 (CIP) 为绿色，化合物谱为蓝色(计算分子式和质量精度列于表1中)。 离子均测定了准确质量数，可计算得到相应的分子式(表2)。每个雷帕霉素1的碎片离子均有一个钠原子作为载荷子。如 果计算得到的碎片分子式不止一种，则选择同母体药物的中性丢失基团匹配的分子式。通过计算出的分子式和母体药物的已 分子式(M) 计算质量数 ▲质量数[mDa] ▲质量数[ppm] C51H79N013 913.55514 1.31 1.44 13 碎片分子式 m/z 碎片 质量数 C51H79NNa013 936.5430 (M+Na)+ 913.5538 丰度 计算丰度% m/z 计算m/z ▲质量数[mDa] ▲质量数[ppm] 100.00 100.00 936.5430 936.54440 1.31 1.40 53.19 56.93 937.5467 937.54770 1.04 1.11 15.35 18.58 938.5477 938.55070 3.03 3.23 3.67 4.43 939.5476 939.55360 6.03 6.42 表1 雷帕霉素1的质谱图、同位素分布、计算分子式和质量精度。 图4 雷帕霉素1的MS/MS谱(计算出的碎片分子式列于表2， 相应的碎片结构如图5所示)。 碎片离子 m/z 碎片分子式 计算m/z ▲质量数[mDa] △质量数[ppm] 中性丢失基团 丢失基团分子式 丢失基团质量数 a 763.47452 C44H68Na09 763.47555 1.03 1.35 173.06961 C7H11N04 173.06881 b 731.44881 C43H64Na08 731.44934 0.53 0.73 205.09533 C8H15N05 205.09502 C 607.39851 C36H56Na06 607.39691 -1.60 -2.64 329.14562 C15H23N07 329.14745 d 453.22349 C25H34Na06 453.22476 1.27 2.81 483.32065 C26H45N07 483.31960 e 441.26150 C25H38Na05 441.26115 -0.35 -0.79 495.28264 C26H41N08 495.28322 f 427.24640 C24H36Na05 427.24550 -0.91 -2.12 509.29770 C27H43N08 509.29890 g 409.23501 C24H34Na04 409.23493 -0.08 -0.19 527.30913 C27H45N09 527.30943 h 381.24004 C23H34Na03 381.24002 -0.02 -0.06 555.30410 C28H45N010 555.30435 i 345.20344 C19H30Na04 345.20363 0.19 0.56 591.34070 C32H49N09 591.34073 j 320.10961 C14H19NNa06 320.11046 0.85 2.66 616.43453 C37H6007 616.43390 表2 雷帕霉素1的MS/MS碎片离子、碎片质量数、碎片分子式、计算出的质量精度和中性丢失基团。 知结构，碎片a-j在MS/MS碎片分布 下面将以 11.98分钟洗脱的羟基化代谢物2为例进行详细介绍。提取的质谱峰显示带 (图6)。 钠的离子 CgH7gNNa0对应 m/z 952.5387 中都得到了匹配(图5)。 雷帕霉素1、其鉴定出的MS/MS碎片 a-j及其羟基化代谢物2的结构式。 分子式(M) 计算质量数 ▲质量数[mDa] ▲质量数[ppm] 13 C51H79N014 929.55010 0.57 0.61 m/z 碎片 质量数 碎片分子式 C51H79NNa014 952.5387 (M+Na)+ 929.5495 ▲质量数[ppm] 丰度 计算丰度% m/z 计算m/z ▲质量数[mDa] 0.60 100.00 100.00 952.5387 952.5393 0.88 49.41 56.97 953.5418 953.5426 3.83 4.01 21.03 18.80 954.5418 954.5456 8.30 6.10 4.55 955.5406 955.5485 7.93 7.52 2.40 0.89 956.5441 956.5513 7.19 羟基化雷帕霉素2的质谱图、同位素分布、计算分子式和质量精度。可计算得到 m/z 929.5495 对应的分子式为 C51H7gNO14，相对质量偏差为0.61ppm (表3)。羟基化代谢物2的 MS/MS谱中的碎片离子也很丰富，非常有助于该代谢化合物的结构解析(图7A)。为进行羟基化代谢物2的结构解析，通过已实现的算法将该化合物的 MS/MS谱与雷帕霉素1的 MS/MS 谱进行比较(图7B)。通过这种比较不仅可检测到重叠的峰，还可观察到在原来的雷帕霉素MS/MS碎片与羟基化代谢物的 MS/MS碎片之间由于生物转化发生漂移的碎片。这些碎片已被标明，并确定了对应的生物转化漂移(图7C)。 MS/MS谱表明羟基化代谢物2在 m/z 952.5387 处的加钠峰来源于一个氧原子导致的母体药物的质量变化。在此MS/MS谱中，原母体药物的碎片离子a和b均不存在，且也不存在由生物转化产生的质量变化。m/z 分别为 607.3927 和345.2040 的碎片离子c和i在代谢物的MS/MS 中保持不变。这些证据表明，羟基化并没有发生在药物分子1的这个部分。代谢产物2的MS/MS谱中的三个碎片离子h'、f'和d'可以认为是原来的碎片离子h、f和d增加一个氧原子得到的(图5和7C)。例如，d'碎片离子的 m/z为 469.2187，计算得到分子式为C25H34Na0，，相对质量偏差为 1.90ppm， 表明它是母体药物谱中 m/z 为 453.2234 的碎片离子dC25H34Na0，增加一个氧原子形成的(表4)。最后，我们假定羟基化代谢物2的结构是由于雷帕霉素的四氢吡喃基发生了羟基化产生的。 图6 羟基化雷帕霉素代谢物2的质谱图、加钠峰和加钾峰的同位素分布。加钠峰的计算同位素分布(CIP) 为绿色，化合物谱为蓝色(计算分子式和质量精度列于表3)。 图71)羟基化雷帕霉素代谢物2的MS/MS谱。2) 雷帕霉素1和生物转化得到的羟基化雷帕霉素2的重叠 MS/MS谱， 标出了质量数漂移归属。3)放大的雷帕霉素1和生物转化得到的羟基化雷帕霉素2的重叠 MS/MS 谱。 碎片离子 m/z 碎片分子式 计算 ▲质量数△质量数 中性 丢失 丢失 FPM 分子式 误差差异 m/z m/z [mDal [ppm] 丢失基团 基团分子式 基团质量数 m/z 差异 [mDal 差异 952.53870 C51H79NNa014 952.53928 0.57 0.61 936.54414 +0 5.32 15.9949 C 607.39275 C36H56Na06 607.39691 4.16 6.86 345.14417 C15H23N08 345.14237 607.39851 5.77 0.00000 d 469.21878 C25H34Na07 469.21967 0.89 1.90 483.31814 C26H45N07 483.31960 453.22349 +0 0.38 15.9949 i 345.20404 C19H30Na04 345.20363 -0.41 -1.19 607.33288 C32H49N010 607.33565 345.20344 0.61 0.00000 表4 ( 羟基化雷帕霉素2的特征 MS/MS碎片、碎片质量数、计算出的碎片分子式、质量精度及生物转化产生的质量变化的归属。 ) 本应用简报介绍了使用代谢产物鉴定软件对具有复杂化学结构的化合物雷帕霉素进行代谢物鉴定。 代谢物鉴定软件所提供的工具对于代谢物鉴定和代谢物结构解析都非常有用。例如，从采集的 Q-TOF 质谱数据，可按照预定义的质量精度范围计算出提取的化合物的分子式，并将同位素分布考虑在内。根据针对各个母离子计算的数据，可计算得到MS/MS碎片分子式。采用碎片离子图谱匹配算法，可对母体药物和代谢产物就相似性以及生物转化带来的质量变化进行比较。 参考文献 1. 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