水体中农药类毒物残留的测定

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近年来，随着淡、海水养殖产业的发展，以破坏生产经营为目的，或是污染排放农药类毒物造成淡水或海水养殖产品中毒死亡的事件明显增多。此类事件小则损失几万元，多则损失几百万元。该类投毒案事件中，由于案发水域水体面积较大，小则几亩多则上百亩，使得水体检材中农药类毒物含量更趋微量，较难检测。本文基于以上考虑，建立了采用全自动固相萃取结合GC/MS、LC/MS/MS定性定量同时测定水体投毒案件中55种农药的方法。本方法采用Oasis HLB固相萃取柱富集水样，二氯甲烷洗脱，GC/MS和LC/MS/MS检测，步骤简单，线性响应良好且干扰小，平均回收率在64.37%~118.76%之间（除甲胺磷与乙酰甲胺磷），RSD小于15%，符合分析与检测要求。关键字：全自动固相萃取；GC/MS；LC/MS/MS；农药自动化样品前处理解决方案-RK-2022-FP002 解决方案 水体中农药类毒物残留的测定 关键词 全自动固相萃取； GC/MS； LC/MS/MS；农药 介绍 近年来，随着淡、海水养殖产业的发展，以破坏生产经营为目的，或是污染排放农 药类毒物造成淡水或海水养殖产品中毒死亡的事件明显增多。此类事件小则损失几 万元，多则损失几百万元。该类投毒案事件中，由于案发水域水体面积较大，小则 几亩多则上百亩，使得水体检材中农药类毒物含量更趋微量，较难检测。本文基于 以上考虑，建立了采用全自动固相萃取结合GC/MS、LC/MS/MS定性定量同时测定水体 投毒案件中55种农药的方法。本方法采用Oasis HLB固相萃取柱富集水样，，-二氯甲烷 洗脱， GC/MS和LC/MS/MS检测，步骤简单，线性响应良好且干扰小，平均回收率在 64.37%~118.76%之间(除甲胺磷与乙酰甲胺磷)， RSD小于15%，符合分析与检测要 求。 1.仪器、试剂以及耗材 1.1仪器和设备 气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890A+5975C）配备EI离子源，色谱柱为 HP-5MS （30m×250µm×0.25µm） 液相色谱-串联质谱仪（Agilent 1260+6410），色谱柱为Eclipse Plus C18 （3.5μm×2.1×100mm） 睿科全自动固相萃取仪：Raykol Fotector Plus 睿科全自动氮吹浓缩仪：Raykol AutoEVA 80 HLB固相萃取柱：RayCure，500mg/6mL，货号：RC-204-36477 C18固相萃取柱：RayCure，500mg/6mL，货号：RC-204-16004 1.2试剂和标准品 乙腈、甲酸、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯试剂，乙酸铵、浓盐酸、氢氧化钠均为 分析纯试剂。 55种农药标准品购于国家标准物质中心，浓度为100 mg/L。详细物质分类见表-1。 有机磷类 乐果、氧化乐果、甲胺磷、乙酰甲胺磷、敌敌畏、对硫磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、丙溴磷、毒死蜱、二嗪磷、伏杀硫磷、杀螟硫磷、甲拌磷、甲基异柳磷、辛硫磷、特丁硫磷、水胺硫磷、亚胺硫磷、三唑磷 拟除虫菊酯类 醚菊酯、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、溴氰菊酯 氨基甲酸酯 异丙威 、仲丁威、甲萘威、呋喃丹、灭多威、涕灭威、涕灭威砜、多菌灵 有机氯类 五氯硝基苯、硫丹 除草剂 丁草胺、二甲戊乐灵 杀菌剂 烯酰吗啉、异稻瘟净、乙烯菌核利、嘧霉胺、三唑酮、腐霉利、异菌脲、苯醚甲环唑、咪鲜胺 杀虫剂 虫螨腈、哒螨灵、吡虫啉、定虫脒、噻虫嗪 表-1 55种农药分类 2.样品富集与净化 2.1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 Raykol Fotector Plus 固相萃取柱 HLB(Raykol, 500mg/6mL) 活化 二氯甲烷、甲醇、水 淋洗 水 洗脱 二氯甲烷 2.2样品制备与富集 依次用5mL二氯甲烷、5mL甲醇和7mL水活化HLB固相萃取柱，取1L水样滤液调 节pH值为6.0-6.5，加入5ml甲醇，以10ml/min的速度上样富集，用10ml水淋洗固相萃 取柱。氮气吹干小柱后用10ml二氯甲烷以1ml/min的速度洗脱，固相萃取程序如图-1所示。用浸泡滤膜的二氯甲烷溶液清洗样品瓶瓶壁，经无水硫酸钠除水后与洗脱液合并，氮吹定容 至1mL。取其中0.5 mL供GC/MS检测，剩余部分加入10mL甲醇，氮吹至近干，用20%甲醇水溶液定容至0.5mL，供LC/MS/MS检测。详细流程如图-1所示。 序号 命令 溶剂 排出 流速 (mL/min] 体积{mLJ 时间Lmi工LJ 1 活化 CH2C12 废液1 20 5 1.1 2 活化 LH3UH 废液1 3 5 2.1 3 活化 H20 爱液1 3 7 2.8 4 大体积上样 废液2 10 1000 150.3 5 林洗 H20 废液1 5 1U 2.6 6 气推 爱液1 20 10 1.3 7 吹干 23 8 青洗注射泵 CH30H 40 2 0.4 9 青洗注射泵 CH2C12 40 2 0.6 10 洗脱 CH2C12 收集 1 10 11.3 11 气推 收集 2 2 1.4 12 气推 收集 20 10 1.3 13 结束 图-1 Fotector Plus水中农药毒物固相萃取方法 3.检测条件 3.1气相色谱-质谱联用条件 进样量：2µL ；进样口温度：280℃ ；进样模式：不分流进样。载气：氦气,流速=1.0mL/min；升温程序：初温60℃保持2min，以20℃/min升温到140℃保持1min，，再以2℃/min升温 到150℃，保持6min，以2℃/min升到170℃，保持6min，以2℃/min升到180℃，保持5min，以6℃/min升到210℃，保持3min，再以10℃/min升温到280℃，保持6min。 离子源温度：230 ℃，质量分析器温度：150 ℃，辅助加热：290 ℃。采集方式：选择 离子监测模式（SIM）；电子倍增器电压：相对电压200V，总电压1671V。 3.2化合物保留时间及定性定量离子 序号 化合物 保留时间 定量离子 离子1 离子2 1 敌敌畏 7.496 109 185 2 甲拌磷 18.542 75 121 3 五氯硝基苯 22.058 237 249 295 4 特丁硫磷 22.471 231 153 5 嘧霉胺 23.34 198 199 6 二嗪磷 24.092 137 179 304 7 异稻瘟净 25.595 91 204 122 8 甲基对硫磷 27.789 263 109 125 9 乙烯菌核利 28.169 285 212 198 10 马拉硫磷 33.289 173 127 158 11 毒死蜱 34.126 341 197 258 12 对硫磷 34.206 291 139 155 13 水胺硫磷 35.116 121 136 230 14 甲基异柳磷 37.637 199 231 241 15 二甲戊乐灵 38.14 252 162 16 腐霉利 40.465 283 96 17 硫丹 41.344 241 195 18 丁草胺 44.182 176 160 237 19 丙溴磷 45.696 337 374 139 20 硫丹 47.772 241 195 21 醚菊酯 48.005 206 131 116 22 虫螨腈 48.699 59 23 三唑磷 51.283 161 257 285 24 亚胺硫磷 54.571 160 25 异菌脲 54.693 314 316 187 26 联苯菊酯 55.18 181 164 27 甲氰菊酯 55.35 181 209 265 28 伏杀硫磷 56.054 182 367 29 氯氟氰菊酯 56.928 181 197 208 30 氯氰菊酯 59.21 163 181 31 氟氰戊菊酯 59.57 199 181 157 32 氰戊菊酯 60.277 419 167 181 33 氟胺氰菊酯 61.185 181 250 34 溴氰菊酯 62.329 181 253 表-2. 34种化合物气相色谱/质谱联用仪保留时间及特征离子 3.3液质联用部分仪器条件 色谱柱：ZORBAXEclipsePlus C18；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流动相A为4mmol/L 乙酸铵（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈；流速：0.3mL/min；梯度洗脱：0-1min, 10%B, 6-9.5min 75% B, 9.51-12 min,95%B, 12.01-16,10% B.；Iron Source: ESI+；Capillary: 4000V；Delta EMV: 300；Gas Temp: 350oC；Gas Flow: 10L/h；扫描模式：正离子扫描MRM。按照该条件 进行检测得到TIC图如下图-2所示。 图2. 21种化合物液相色谱/质谱联用仪TIC图 3.4液质MRM参数 序号 化合物 保留时间 母离子 子离子 驻留时间 碎裂电压 碰撞能量 1 8.232 406.1 337 10 130 14 苯醚甲环唑 250.9 10 135 24 2 烯酰吗啉 7.013 388.2 301 10 105 22 164.9 10 105 36 3 咪鲜胺 7.759 376.1 308.1 10 95 6 266 10 95 12 4 哒螨灵 11.725 365.2 309.1 20 95 10 147.1 20 95 28 5 辛硫磷 8.773 299.1 129.1 10 110 32 77 10 110 50 6 三唑酮 7.514 294.1 197 20 90 14 69 20 90 24 7 噻虫嗪 4.309 292 211.3 10 90 10 181.1 10 90 22 8 吡虫啉 4.896 256.2 209.2 10 80 18 175.1 10 80 20 9 乐果 4.995 230.1 199.1 10 90 3 170.9 10 90 10 10 氧化乐果 4.674 214.1 183.1 10 100 30 154.9 10 100 15 11 涕灭威砜 3.358 223.1 86.2 10 115 12 148.1 10 115 4 12 定虫咪 5.071 223.1 126 10 120 18 56.1 10 120 13 13 呋喃丹 6.269 222.2 165 10 90 8 123 10 90 22 14 仲丁威 7.848 208.1 152.1 10 70 10 95 10 70 16 15 甲萘威 6.445 202.1 145 10 60 8 127 10 60 34 16 异丙威 6.770 194.2 137 10 70 6 95.2 10 70 14 17 多菌灵 2.804 192.1 160.1 10 110 18 132.1 10 110 30 18 1.482 184.1 143 10 135 5 乙酰甲胺磷 95 10 135 20 19 灭多威 3.715 163.2 106.1 10 60 4 88.1 10 60 2 20 甲胺磷 1.296 142.1 125.1 10 110 8 94.1 10 110 10 21 涕灭威 5.637 116 89.1 10 80 6 70.2 10 80 6 表-3. LC/MS/MS保留时间以及质谱参数 4.方法可行性验证 4.1空白加标回收率验证 本文建立的方法其准确性与精密度采用加标回收率与相对标准偏差(RSD)进行衡量。在空白 水样中分别添加浓度为0.5 μg/L的55种农药类毒物，按照上述3.2方法进行固相萃取操作。实验结果表明：绝大部分化合物的平均回收率在64.37％~118.76％之间（除甲胺磷与乙酰甲 胺磷），RSD小于15%，符合分析与鉴定要求。 化合物 平均回收率（%） RSD（%） 敌敌畏 74.56 10.04 异丙威 85.17 14.57 仲丁威 98.07 14.80 甲拌磷 66.75 2.99 五氯硝基苯 70.22 10.03 特丁硫磷 77.45 13.85 嘧霉胺 115.45 10.78 二嗪磷 112.60 6.24 异稻瘟净 108.18 12.69 甲基对硫磷 86.22 8.45 乙烯菌核利 98.42 2.37 氧化乐果 76.05 7.40 马拉硫磷 83.43 7.46 对硫磷 85.63 9.08 毒死蜱 85.71 4.39 三唑酮 101.26 7.58 三三Raykol 水胺硫磷 73.99 8.04 甲基异柳磷 98.03 7.70 二甲戊乐灵 75.46 7.66 腐霉利 86.92 13.91 硫丹 82.68 7.71 丁草胺 89.21 21.65 丙溴磷 78.95 4.91 醚菊酯 108.34 9.82 虫螨腈 98.67 0.86 三唑磷 77.20 9.67 亚胺硫磷 66.32 9.62 异菌脲 46.69 6.36 联苯菊酯 77.53 9.02 甲氰菊酯 94.73 7.78 杀螟硫磷 83.35 7.63 氯氟氰菊酯 64.37 4.11 哒螨灵 78.20 9.23 氯氰菊酯 68.11 12.80 氟氰戊菊酯 75.40 11.70 烯酰吗啉 118.76 11.14 溴氰菊酯 79.78 6.09 氟氨氰菊酯 89.94 13.65 氰戊菊酯 93.49 11.40 伏杀硫磷 84.20 12.23 乐果 89.22 1.88 甲胺磷 12.52 9.80 苯醚甲环唑 103.31 10.58 噻虫嗪 73.57 4.01 灭多威 117.41 6.56 呋喃丹 89.36 10.90 甲萘威 73.82 6.15 多菌灵 75.44 1.12 定虫咪 105.63 0.15 吡虫啉 104.97 3.73 乙酰甲胺磷 19.73 6.22 涕灭威 86.52 7.23 涕灭威砜 83.06 4.95 辛硫磷 71.57 8.42 咪鲜胺 101.44 6.49 表-4. 0.5μg/L加标回收率及RSD(n=3) 5.结果与讨论 5.1检测分类 将55种化合物配成混标，分别用GC/MS和LC/MS/MS进行检测，根据响应值选择合适 的上机方式。 5.1.1有机磷类农药， 甲胺磷、乙酰甲胺磷、辛硫磷、乐果和氧化乐果具有难挥发性、热稳定性差的特点，在 GC/MS灵敏度及响应较低的情况，采用LC/MS/MS检测；其他部分有机磷农药采用GC/MS 检测。 5.1.2氨基甲酸酯类农药 该类化合物极性较强、热稳定性较差，在气相分析温度下易发生分解；采用GC/MS检 测，只有异丙威与仲丁威的响应比较高，其他物质响应低或无响应；故氨基甲酸酯类采用 LC/MS/MS进行检测。 5.1.3有机氯以及拟除虫菊酯类农药 该类化合物GC/MS上的响应值较好。因此这一部分可以放在GC/MS上进行监控，另外 氯氰菊酯以及溴氰菊酯在GC/MS上响应值较差，因此建议在前处理时增加浓缩倍数。 5.1.4杀菌剂及除草剂 该类化合物除了咪鲜胺在GC/MS上的响应值比较差，其他化合物在GC/MS上都有比较 好的响应，因此采用GC/MS（咪鲜胺除外）进行检测。 5.1.5杀虫剂 该类化合物在GC/MS上的响应值都比较低，在LC/MS/MS上都有一定的响应值，因此 采用LC/MS/MS上进行建立谱库监控。 5.2固相萃取柱的对比 进行水中的农药毒物残留物分析中，多数情况下应该选择反相固相萃取或者是以反相固 相萃取为主要作用力的混合型固相萃取柱来进行检测，另外可电离的化合物则可以考虑用离 子交换柱进行固相萃取如百草枯，草甘膦等，因此结合本次试验的目标化合物，选择了HLB 固相萃取柱以及C18固相萃取柱进行比较。 根据试验数据进行比较，发现HLB固相萃取柱在进行有机氯与拟除虫菊酯的萃取上同等 情况下回收率略低于C18固相萃取柱，甲胺磷、乙酰甲胺磷在C18柱上基本没有回收率，在 HLB固相萃取柱上回收率约为10%左右，乐果，氧化乐果、噻虫嗪、灭多威、涕灭威亚砜等 几种物质在C18固相萃取柱上的回收率约为HLB固相萃取柱上的1/2，而克百威、甲萘威、 涕灭威的回收率比C18固相萃取柱要高一些，从上述的总结发现，中等极性以及弱极性化合 物C18固相萃取柱的回收率要略高于HLB固相萃取柱，而强极性的化合物HLB柱要优于 C18固相萃取柱，这是因为HLB与的非极性作用力要略小于C18，但是HLB添加的辅助基 团有比较好的极性作用力吸附，而C18只有非极性作用力吸附，因此在强极性化合物的情况 下，C18不能很好的将其吸附，HLB可以通过复合作用力进行作用达到吸附的效果。 公安系统一般情况下需要对检材进行有毒物质的筛查，极性以及非极性物质都有可能出 现，因此在未知物检测的情况下，应该以通用性固相萃取柱为主，而回收率则成为次要的因 素，因此本文最后决定使用HLB固相萃取柱进行条件优化。 5.3 pH值对各种目标化合物的影响 本文分别在pH=3, pH=6.5, pH=10三个条件对55种目标化合物进行固相萃取，以探讨在 合适的pH范围内对水样的处理与保存。 在不同条件下，部分的化合物的回收率差异较大，具体请如下 碱性条件下(pH=10)部分化合物回收率差，或者几乎没有回收，如有机磷农药，氨基甲酸 酯农药，拟除虫菊酯这类的农药随着pH值升高迅速的水解，因此在碱性条件下几乎没有回 收；如本实验中的敌敌畏，在酸性条件下，平均回收率为85.2%，而中性条件下平均回收率 为74.6%，而pH=10时则迅速的降至0.42%。 乐果、呋喃丹等在酸性条件下回收率较差，经过分析，这一类的农药因为含有胺基，如 伯胺基或者仲胺基等，在酸性条件下会生成铵根正离子，而离子化合物所产生的库仑力要远 远大于HLB固相萃取柱与目标化合物产生的极性或者非极性力，因此这一类的化合物在酸性 条件下难以在固相萃取柱上吸附而造成回收率较低，如本实验中的乐果，在中性条件下回收 率能够达到80.3%，而酸性条件下回收率则只有39.7%，因此这一类的化合物需要在中性条 件下进行固相萃取才能保持较好的回收率。 因此本文经过综合考虑，选定在弱酸性（pH为6.0~6.5）条件下进行固相萃取能够兼顾 到所有目标化合物的测定。 5.4过滤对整个检测过程的影响 在实验过程中发现，样品经过过滤后，拟除虫菊酯类以及有机氯类的回收率会有一定程 度的下降，浓度越高现象越明显，经过资料查询后分析认定，由于拟除虫菊酯以及有机氯类 农药在水中的溶解度非常低，当水中含有泥沙，藻类，浮游生物等颗粒物的情况下，容易析 出后附着在颗粒物上，但是颗粒物过多会堵塞固相萃取柱，所以需要对样品进行过滤，而附 着在颗粒物上的化合物则会被除去造成回收率下降，因此在最终测定时需要对滤膜进行浸泡 萃取合并后才能阻止这一部分损失。