生物制剂研究人员必备技术指南-如何使用nanoDSF进行候选目标筛选

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01 / 前沿技术分享什么是nanoDSF技术 ？基于微量差示扫描荧光技术 (nanoDSF) 技术，可在天然条件下检测蛋白热变性和化学变性。蛋白中色氨酸和酪氨酸的荧光与其所处的环境密切相关。免标记的nanoDSF技术可以准确检测蛋白热变性和化学变性过程中内源荧光的变化。因此，通过检测荧光变化，可实现在非标记环境下测定蛋白的热稳定性或化学 稳定性。更重要的是，数据质量不会受样品聚集影响。高质量的数据助您做出更好的决定。PR系列是通过检测蛋白的内源性荧光来跟踪其折叠状态。荧光信号的比值会随着温度的增加或化学变性剂浓度的增加而变化，从而测定蛋白稳定性参数Tm值。02 / 技术应用nanoDSF技术的应用方向 ？在生物制剂研究人员日常工作中，早期可开发性评估最常见的关键质量属性（CQAs）是热稳定性。其中，高分辨率评估热稳定性的一个特殊工具是纳米差示扫描荧光法（nanoDSF），它从基于蛋白质的治疗药物的内在荧光中导出参数Tm和Ton。当您面临许多候选目标或缓冲区条件需要筛选时，nanoDSF技术可使用少量样本，适用宽泛的浓度，得到高品质的数据，作为一种不可或缺的首轮筛选技术使您可以看到前所未有的精度，发现候选者之间的细微的差异。03 / 下载收藏nanoDSF技术的应用方向 ？下载这份nanoDSF技术指南, 您可获取如下信息：nanoDSF是如何利用蛋白质的固有荧光来确定其熔解温度Tm?为什么高分辨率展开数据对于获得单克隆抗体的稳定性信息至关重要？nanoDSF数据的实际示例是什么样的？以及您可在实际数据中查看哪些信息？通过这份指南，您可以更快地选择最有发展潜力的候选目标: 查看来自抗体工程、抗体-药物偶联（ADC）、生物仿制药开发和制剂开发的真实数据， 并学会一目了然地解读它。详细了解PR Panta如何为您的生物制品决策提供最高质量的数据。04 / 企业愿景关于NanoTemperNanoTemper公司的使命是为科研人员创造强大的生物物理学工具，以解决表征中最具挑战性的难题。我们非常兴奋能够同致力于改变世界的药物研发或与基础研究科学家合作，为实现公司愿景-创造一个任何疾病都可以被治疗的世界而不断前行。如果您在亲和力筛选、分子相作、蛋白稳定性或蛋白生产等方面遇到挑战，欢迎随时联系我们。● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● C ● ● ● ● C ● ● C ● ● ● ● ● ● .... 从蛋白质的固有荧光中获得稳定性信息 ， 以更好地评估基于抗体的候选药物的可开发性。 了解高分辨率热变性数据的重要性， 以便更快、更全面地表征候选分子 ， 从而更快地缩小候选生物分子的范围。 nanoDSF是如何利用蛋白质的内源荧 为什么高分辨率热变性数据对于获得 nanoDSF数据的实际示例是什么样的?光来确定其熔解温度T 单克隆抗体的稳定性信息至关重要? 以及您可在示例中查看哪些信息? 更快地挑选出最有发展潜力的候选目标： 查看来自抗体工程、抗体-药物偶联物、生物仿制药开发和制剂开发的真实数据，并学会一目了然地解读它 。 高分 辨率、高精 度 的 热变性数 据 ，以 发现甚 至 是候选药物之间最 微 妙的差异 理想的可开发性评估筛选为您提供了一个候选分子进行后 续管线工作的开展。然而，一 旦从数百到数千名候选目标 中 选择了错误的候选分 子 ，或者筛选后仍剩 下 太多候选目标，则意味着要花费更多的时间和成本来继续寻找更好的选择。 候选生物制剂的选择参考了许多生物物理参数，但在管线早 期预测可开发性的筛选，最常用参数是热稳定性(the r ma l s t abi l i ty)。 候选材料是根据检测熔解温度(Ts)的热变性实验进行分 类的。通过对T进行排序，具有最高的T值的候选材料则是 热稳定性最佳的分子 na n o D SF 可以检测 单 克隆 抗 体 的 哪 些 信 息呢 ? nanoDSF利用蛋白质固有的荧光——它的色氨酸和酪氨酸残基—来跟踪它随温度升高而展开的变性过程。 T 值是蛋白质在一半折叠和一半展开时的温度。对于大型-多结构域 的蛋白质，如单克隆抗体-有多个 Ts ，对应于不同结构域的展开。这 些 都可以通过nanoDSF技术提供的高分辨率热变性数据识别出来。 凭借其高质量的数据， nanoDSF揭示了T.s的细微变化，多结构域转 换，甚至揭示了变性的起始温度，T，精确地指出了蛋白质开始变 性 的位置。低 T s表明蛋白质不太稳定，即使T是 一 个相对较高的温度 。 ○ 示图为单克隆抗体 (NISTmAb， 10.0 mg/ml， 1.08 12.5 mM 组氨酸缓冲液 pH 6.0)的典型热变 性曲线。 1.06 比率图(顶部)显示了当疏水残基在热变性后 暴露于溶液中时，荧光比率如何变化。一阶导 1.04 数视图(底部)使识别这些转换变得容易。 1.02 0.98 Tm， Fc1 domain 第一个T对应于Fc1结构域，是mAb候选物的首 0.006 选排序参数之一 0.005 Tm，Fab domain 0.004 Tm， Fc2 domain 0.003 T 和T，在单克隆抗体中通常非常相似，导致只 0.002 有一个过渡(通常标记为T，，但同时代表Fab和 0.001 Fc2结构域) 0 Ton， onset of unfolding T 是热变性开始的点，是稳定性评估的另一个有 -0.001 -0.002 Tm，Fab domain Tm， Fc2 domain T 和 T ，在单克隆抗体中通常非常相似，导致只 有 一 个过渡(通常标记为T ，，但同时代表Fab和 Fc2结构域) Ton， onset of unfolding 用参数 当 T 和 T 相 近时 ，说 明该样 品 的热 稳 定 性 相 对 于 这 两 个 参数相 差 较大 的 样 品 而言，表现 更好 。 抗 体 工程 有各种各样的方法来创造新的抗体疗法。一 般来说，从已经被证 明能够有效靶向和结合感兴趣的蛋白质的单抗开始，并将其作为 起点，以提高其稳定性和亲和力，使其成为更有效的治疗药物。 通过随机突变、合理设计的突变或计算机模型指导的突变来优化 该分子，可提高治疗性单抗的可开发性。然而，即使是一个单点突 变也可能对你的候选分子的稳定性产生巨大的影响——无论是好 是坏。 检查蛋白质 工 程对候选分子稳定性的影响是至关重要的。有了高 分辨率的nanoDSF数据，就可以清楚地看到，仅仅几个点突变就 会对T值产生影响—-增加或降低稳定性程度一般仅仅只有几 摄氏度的差异。 Temperature [℃] 抗体 偶 联药物A DC 抗体-药物偶联物(ADCs)结合了单抗的靶向能力和小分子药物的治疗能 力。然而，偶联过程引入了一个新的反应环境，影响单抗的稳定性。此外，在 单抗中加入小分子会影响偶联发生的结构域的稳定性。 借 助高分辨率nanoDSF技术，不仅可以评估偶联过程中发生的整体稳定性 变化，还可以评估药物偶联的特定区域。 偶 联 过程通常会给 抗 体引 入 苛刻或不稳 .95 定的 条 件 ，这 将 对 其 长期稳定 性和可 发 展 性产生 负 面影响 。 0.9 通过 比 较最终AD C 候选物 与 原 始裸 (未偶 0.85 联)单抗的热变 性 曲 线，可 以 了 解 候 选 分 子 在此过程 中 是 否 保持稳定，甚至可 以 确 0.8 定药物偶 联 的结 构域。 0.75 ADC 0.7 naked mAb 30 40 50 60Temperature (℃) 70 80 90 100 T 中 的 不稳定位 移 表 明小分子 药 物共 轭 到 F c 1结 构 域 ○然 而 ，T，(Fa b /F c2)没 有 移位 ，而 且 非 常 相似 的 图 谱 表 明 ，偶联过程 使 单抗保 持 完 整 Temperature (℃) 生物 仿制药 生物仿制单抗必须尽可能与母体治疗药物相似。与前面的例子不同，目 标不是增加T或 T，事实上，目标是保持热变性曲线尽可能与原始相 似。这是监管机构的关键证据，要求生物仿制药与其参比生物药没有临 床意义上的差异。 为了获得相似性值的最佳准确性，从热稳定性实验中获得 高 分辨率数 据至关重要。这可确保您的生物仿制药与原研药物最为相似，从而满足 监管机构的要求。 高 分辨 率的数 据 结 合 精确的建模 能够 准确 地 显 示生 物仿制 药在 热稳定 性方 面偏离 其 原始产品的程度。有 了这 些信息 ，就 有可 能 找到一 个与原始 分 子高度 相 似 的 候 选分 子。 通过一个数学模型发现生物类似 药样品的一阶导数图与原始样品 的重叠，以便对最佳候选药物进行 快速排名 Sample 1st Derivative Overlap Index Rank 1 0.492 17 2 0.461 13 3 0.306 2 4 0.446 9 5 0.488 16 6a 0.461 14 6b 0.423 6 7 0.458 12 8 0.403 4 9 0.433 7 10 0.438 8 11 0.111 1 12 0.464 15 13 0.455 11 14 0.452 10 15 0.332 3 16 0.423 5 制 剂 筛 选 无论你在研究哪种生物制剂，你都必须优化它们的最终配方。这是生物 将被储存和/或递送的缓冲环境。 制剂工作是一个额外的筛选步骤，考察不同的pH值、缓冲体系和添加 剂。整个缓冲筛选方法已经被开发出来以加快这一过程，但也意味着另 一 轮缩小最佳选择-这一次是针对您的候选目标的化学环境。 选择何种缓冲液，需要重复检 查 生物热变性曲线的细微变化。在许多情 况下，这不仅仅是评估 T的 增加，而是评估整体热稳定性。添加剂可能 会对稳定性产生适度但有意义的影响，因此依靠高分辨率的数据进行 评估十分重要。 根据 缓 冲 环境的不 同，相 同 的 候 选 材 料表现出非常 不 同 的热 变 性行为。 在这里， n an o D SF揭 示了 三 种不 同的缓 冲液 对He rc e pt i n TM(一种 靶 向 癌 症 的单 克 隆抗 体治 疗药 物)的 影响 。 请注意，较低的pH值有一 个 权衡，其中构象稳定性降低，但胶 体稳定性增加*。 虽然热变性的构象稳定性是有 价 值的筛选第 一 步工具，但请 注 意 ，还有其他评估稳定性的方法，并且通常需要平衡 它 们。 ○较低的pH缓冲液稳定了T/Tm3，从而降低了聚集倾向 较低pH缓冲液使T不稳定 Temperature (C) *了 解更 多 关 于 pH 值对胶体稳定性的 影 响 结 论 有 了 高 分辨率nanoDSF数据确定的T s 和 T s ，无论您正在进 行 哪种 生 物制 剂 实验，都有可能更有效地缩 小 管线。从 候 选材料 的 热变性曲线中获 得 的信 息 使 您能够对可开发性的最佳候选材料进行排名 。 这份指南介绍了 一 些不同的生物制剂实验，以 及如何利用na n oD SF 技 术。 执行有意义的稳定性评估的共同主线是什么?当您需要辨别候选数据之间哪怕 是最微小的差异，以便做出更好的决策时，就需要模范性的数据质量和分辨率。 通过生物制剂热稳定性的高质量数据，结构和条件之间的细微差异就会被揭示 出来，使选择过程更快，更直接。 查看这些资源，了解更多关于本指南中的数据： https：//resources.nanotempertech.com/application-notes/stabi l ity -opt i mization -of-engineered-mabs https：//resources.nanotempertech.com/application -notes/applicati o n -note-nt-pr-011-chemical -unfolding-of-mabs http s：//resources.nanotempertech.com/app l ication-notes/application-n ote-nt-pr-010-biosimilar-profil i ng https：//re sources.nanotempertech.com/biologics/an-applicat ion-of-nano-differential-scanning-fluorimetry-for-higher-order-structure -assessment-between-mab-originator -and-biosimilars https：//resources.nanotempertech.com/biologics/exploring-chemical-space-for-new-substances-to-stabilize-a-therapeutic-monoclonal-antibody https ：//resources.nanotempertech.com/biologics/nano-differentia l-scanning-fluorimetry-for-comparability-studies-o f -therapeutic-pro teins https：//resources.nanotempert e c h .co m/bi olog i cs/h ow -st ab ility -stu d ie s-ge t -ma b -fd a -ap pr ov ed https ：//resources.nanotempertech.com/b iol ogics/use-o f -high-through put -methods -for -ea r ly-stage-formulation-evaluation-and-their -correla tion-to -stabil i ty-studi es https：//resources.nanotempertech.com/application -notes/application-note -nt-pr-009-chemical -and -thermal -unfolding https：//resources.nanotempertech.com/application-notes/applicat i on-n ote-nt-pr-003-antibodies nanoDSF并不是唯一提供可开发性参数的技术。了解另 一 项有价值的技术， DLS ， 以及它如何增加尺寸，纯度和分散性信息， 可进 一 步完善您的生物选择过程： M O TEMPER NanoTemper公司的使命是为科研人员创造强大的生物物理学工具，以解决表征中最具挑战性的难题。 电话：+86(10)-8446 2100更多产品信息，请参考官网或关注微信公众号 https：//n gno t e m pertec h .com/zh c n/p r ome t heus -f o r-b iologics /