利用密度梯度超速离心法从水稻中分离高尔基体

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获得高质量的高尔基体分离物，对于进一步分析和理解这种细胞器至关重要。由于高尔基体与内质网（ER）等其他膜系统形成了复杂结构，因此分离这种细胞器的不同部分尤其困难。事实上，高尔基体膜的某些部位还经常会被液泡等其他相连的膜系统污染。因此，在本应用说明中，我们将使用一系列差速离心和密度梯度离心操作（富集特定膜系统的最成熟技术之一），从水稻幼苗中获取高尔基体膜。用这种技术可以获取高纯度、高质量提取物并用于质谱等进一步的下游分析。下面我们将详细介绍使用CP80NX 落地式超速离心机（搭配P32ST 和P40ST 水平转子）分离获取高质量高尔基体的过程。实验设备：CP80NX 超速离心机搭配以下水平转子：P32ST 型水平转子，适用于40 mL PET 离心管   2. P40ST 型水平转子，适用于13 mL PET 离心管实验结果：eppendorf APPLICATION NOTE INo.4441 Page 2eppendorf 密度梯度超速离心法从水稻幼苗中分离和 富集高尔基体 Kazusato Oikawal， Shuichi Kani， Mark Hunken 1 Lab for Biomaterial Chemistry， Kyoto， Japan ·Eppendorf Himac Technologies， Tokyo， Japan·Eppendorf AG， Hamburg， Germany 摘要 获得高质量的高尔基体分离物，对于进一步分析和理解 这种细胞器至关重要。 Himac 目前隶属于 Eppendorf 集团，拥有60多年定制研发落地式超速离心机的丰富 经验。在本应用说明中，我们将采用 一 系列差速离心和 非连续蔗糖密度梯度离心操作，使用 Himac CP80-NX 离心机(搭配 P32ST 和 P40ST 水平转子)从水稻幼苗 中分离高尔基体。 引言 120多年前，卡米洛·高尔基(Camillo Golgi)首次发现 了 真核 细胞的高尔基体。之后，(电 子 )显微技术的发展揭示了高尔基 体的复杂结构，而进一步的生化分析则阐明了细胞内这种细胞 器的各项功能[2]。 在高 等 生物细胞中，作为分泌途径的一部分，高尔基体负责合 成复合多糖体、加工蛋白质并将蛋白质分配到其他细胞器中 (图2)[1]。 图1：搭载 P32ST 和 P40ST型水平转 子 的CP系列超速离心机 叶绿体蛋白质 的 转运机制 (1)通过T OC -TIC 复合体的正常 转 运途径 (2)通 过 分 必途 径的特殊转运 途 径 (ER-高尔基体) 图2：植物细胞通过以下途径完成蛋白质转运：(1)Toc -Tic 复 合 体转运机制(2)高 尔基体和分泌途径 a- 淀粉酶就属于此类蛋白质，它是一种负责植物内淀粉分子水 解的糖苷酶。研究表明， a-淀粉酶在内质网(ER)核糖体处合成 并在内质网内腔中糖基化后被输送到高尔基体进行低聚糖改 性[3]。然而，由于高尔基体 与 内质网(ER)等其他膜系统形成了 复杂结构[2]，因 此分离这种细胞器的不同部分尤其困难。事实 上，高尔基体膜的某些部位还经常会被液泡等其他相连的膜系 统污染[2]。因此，在本应用说明中，我们将使用一系列差速离 心和密度梯度离心操作(富集特定膜系统的最成熟技术之 一 )[2]，从水稻幼苗中获取高尔基体膜。用这种技术可以获取高纯 度、高质量提取物并用于质谱等进一步的下游分析。下面我们 将详细介绍使用 CP80-NX超速落地式离心机(搭配 P32ST和 P40ST 转 子 )分离获取高质量高尔基体的过程。 材料与方法 所用材料 CP80NX超速离心机搭配以下水平转子： 1. P32ST型水平转子，适用于 40 mL PET离心管 2. P40ST 型水平转子，适用于 13mL PET 离心管 第1步： 使用 P32ST型水平转子(40mL PET离心管)和P40ST型 水平转子(13 mL PET 离心管)，完成微粒体纯化过程。 1.在4℃条件下，使用水平转子，在40 mL PET 离心管中以 15，000xg的速度离心纯化水稻提取物30分钟，并移除沉 降物。 2. 在 13 mL PET 离心管中，底部铺垫1mL 50%浓度蔗糖 溶液，中间层装入1mL 15%蔗糖溶液，顶部装入11mL 上 清液。15%蔗糖溶液置于 1 mL 50%蔗糖垫层之上，将 11 mL 上清液装入1mL 15%蔗糖溶液顶部。 3.在4℃条件下，以100，000×g的离心力离心3小时，然 后收集50%蔗糖垫层溶液中截留的微粒体部分。 第2步： 使用P40ST型水平转子(13mL PET离心管)，从微 粒体部分纯化高尔基体 。 1.使用手持糖量仪，利用60%蔗糖缓冲液将收集的微粒体 蔗糖溶液密度中和至42%。在该溶液上层装入1-2 mL其他 非连续蔗糖密度梯度，每个梯度由1mL浓度为26%、30%、34%和38%的蔗糖层组成。随后，小心地加满水至 13mL。 图3：采用 一 系列非连续蔗糖梯度离心步骤分离高尔基体 。通过两个单 独的浮选分离步骤即可获得高纯度高尔基体 。 2.4℃，100，000×g离心3小时，然后迅速收集漂浮在 34%和38%蔗糖层之间界面相的高尔基体部分(1)。 3.再次将收集的高尔基体部分中和至蔗糖密度42%，然后 再次装入 1-2 mL 不连续的蔗糖梯度溶液，每个梯度由1mL 26%、30%、34%和38%的蔗糖层组成。小心加满水至 13mL 。 4.4℃， 100，000 × g离心3小时，然后收集漂浮在34%和 38%蔗糖层之间界面相的高尔基体部分(2)。 通过使用细长的13 mL离心管完成两次浮选离心，即可从微粒 体中分离出高纯度的高尔基体。回收后的高尔基体部分(2)可 用于实验和印迹分析。所有蔗糖浓度单位均为质量百分比 (w/w)。 结果与讨论 非连续密度梯度离心法 是 分离或富集亚细胞成分的标准方法。在大多数情况下，我们利用沉降系数或特定密度的差异来获得 分离物。 在细胞器的分离应用中，决定这些分离参数的主要因素是相应 膜的组成成分。 获得高纯度的分离物通常比较困难，这一点在与其他膜系统紧 密相连的高尔基体[2]上尤为明显。 因此，高纯度的高尔基体膜对于分析和研究高尔基体蛋白质 组[1]或细胞器内特定的蛋白质至关重要。 本文使用了两种不同型号的水平转子，配合一系列非连续蔗 糖密度梯度离心步骤，高效可靠地获得了高质量的高尔基体 分离物。 在弃掉第一道离心步骤中的细胞碎片后，将上清液装入第一个 非连续的蔗糖梯度上(见图3)。在15%和50%的蔗糖相之间 为富集的微粒体部分。随后，微粒体部分通过两次非连续的蔗 糖梯度浮选分离步骤而进 一 步被纯化，其中高尔基体沉积在梯 度为34%和38%的蔗糖相之间(图3)。Asakura 等人[4]的 研究表明，经过第二次浮选分离操作后，高尔基体部分的纯度 显著提高。可以采用免疫印迹法对以下标记酶进行检测，进而 对高尔基体的质量进行分析：例如 UGPase(尿苷 二 磷酸葡萄 糖焦磷酸化酶：细胞质基质)、RbcL(二 磷酸核酮糖羧化酶长 链：质体)、COXII(细胞色素C 氧化酶亚基2：线粒体)和ARF (腺苷核糖基化因子：高尔基体)。 和38%蔗糖溶液之间的高尔基体部分用红色表示。 结论 水平转子 P32ST 和 P40ST 是 分离高尔基体的理想选择，两者 搭配可以实现从40mL大容量离心管到13mL小容量离心管 的流畅切换，同时保证了优秀的离心效果。Himac 13 mL PET 离心管采用 了 特殊的细长造型，可实现更长的浮选距离，从而 提升了高尔基体部分的纯度 。此外，转 子 采用的顶部装载设计，便于完成蔗糖梯度处理的精细操作，并且可以将 意 外混合污染 的风险降至最低。 Literature [1] Oikawa K. et al. (2018)： Proteomic Analysis of Rice Golgi Membranes Isolated by Floating Trough Discontinuous Sucrose Density Gradient， Methods in Molecular Biology， Chapter 6， 91-105. [2] Parsons H.T . et al. (2012)： The Current State o f the Golgi Proteomes， Proteomic Applications in Biology， Dr. Joshua Heazlewood (Ed.). [3] Kitajima A. et al. (2009)： The Rice a-Amylase Glycoprotein Is Targeted from the Golgi Apparatus through the Secretory Pathway to the Plastids； The Plant Cell， Vol.21： 2844-2858. [4] Asakura T. et al.(2006)： Isolation and proteomic analysis of rice Golgi membranes： Cis-Golgi membranes labeled with GFP-SYP31. Plant Biotechnology 23， 475-485. Ordering information Description Order number CP80NX 超速落地式离心机 5720108011 P32ST 水平转子，包含水平吊篮，6×40mL 5720 214 003 P40ST 水平转子，包含水平吊篮，6×13mL 5720214002 PET 离心管，13 mL 5720 411 107 PET 离心管，40mL 5720411148 www.eppendorf.cn Eppendorf China Limited 艾本徳 中 国有限公 司 上 海：021-38560500 北京：010-88360998 广州 ：020-83754160 服务热线：400885 6070 电子 邮件 ： marketinfo@eppendor f .cn www.eppendorf.com/your-centr i fuge-solution E ppen dorfan d t h e Eppe n do r f br a n d d es ign a r e r eg ister e d tr ade ma r ks of Eppendo r f S E ， Ham bu rg ， G e r m any .H imac " i s a r eg is te re d tr adem a r k of E pp e nd orf H im ac Te chnolog i e s C o.， Hima c E p pe n dorf G r ou p is a tra d emark of E pp e nd orf SE ， Ha m burg ， G e rma n y. A ll rig ht s reser ved， incl u di ng gr a phics and i mage s . C op y ri g ht @ 2021 by Eppe n dor f SE， H a m bur g， Ge r m a n y . E ppendo r f S E re s e r ve s t he r i ght to modi f y it s p r o d u cts and s e rv ic e s a t a ny t ime . T h i s a ppl i c at i o n note is su b jec t to c h a ng e with ou t no tic e . A l t ho ugh pr e par e d t o e ns ur e accuracy， E pp e nd or f SE ass u m e s n o lia bil it y f or e r r or s ， or for any da mages r esu lt ing fr om the a pplica tion or u se o f t his i n format ion . Vi e wing a ppl ica ti on no tes a lo ne c a nnot a s s uch pr ov i d e for or r e place r ea di ng a nd r e s p e c t i ng t he c u rr e n t ver s ion of the o pe ra t in g m anual .