LCMS-2050检测扑热息痛中遗传毒性杂质4-氯苯胺含量

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本文建立了一种使用高效液相色谱质谱联用仪LCMS-2050定量测定扑热息痛片中4-氯苯胺遗传毒性杂质的新方法。本方法线性范围宽、灵敏度高、重复性好、准确度高、前处理简单，可实现扑热息痛中痕量遗传毒性杂质4-氯苯胺的高灵敏度、快速检测。SSL-CA23-156Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-046 LCMS-2050 检测扑热息痛中遗传毒性杂质 4-氯苯胺含量 LCMS-046 摘要：本文建立了 一 种使用岛津高效液相色谱质谱联用仪 LCMS-2050 检测 扑 热息痛中遗传毒性杂质4-氯苯 胺含量的新方法。样品以50%甲醇水溶液溶解定容，滤过后上机分析 。采用外标法定量，在1~500 ug/L范围内，相关系数大于0.999。三个浓度下保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD) 分别在0.05~0.07%和0.37~1.26%之间。该方法灵敏可靠，4-氯苯胺定量限为1ppm， 远低于浓度限度值 17 ppm； 三个浓度样品加标回收率在 93.1~97.4%之间；残留实验结果为阴性，可为扑热息痛中遗传毒性杂质4-氯苯胺含量测定提供参考 。 关键词：单 四极杆质谱 4-氯苯胺 扑热息痛 遗传毒性杂质 技术特点： 心使用 LCMS-2050建立了一种检测扑热息痛中遗传毒性杂质4-氯苯胺含量的新方法。 遗传毒性杂质 (Genotoxic Impurity， GTI) 是指 化合物本身直接或间接损伤细胞 DNA， 产生基因突变 或体内诱变，具有致癌可能。其在极低浓度时即可造 成人体遗传物质的损伤，导致基因突变并促使肿瘤发 生 。因其毒性很强，对药物的安全性造成巨大威胁。 扑热息痛又名对乙酰氨基酚，具有解热镇痛作用，是感冒药中的主要成分。据荷兰媒体报道，曾在一家 制药公司生产的扑热息痛 中 检测到4-氯苯胺。4-氯苯 胺是苯胺类遗传 毒 性杂质，作为药物合成的起始物料 和中间体而被广泛应用。4-氯苯胺对细胞存在潜在毒 性，因此 需 要控制其在药物中的含量。ICH M7指 南 《评 估和控制药品中 DNA反应性/诱变性杂质以限制潜在 致癌风险》附录中所规定的4-氯苯胺可接受摄入量为 34 ug/day， 通 常 成人服用扑热息痛的最大日摄入量为 2g，故4-氯苯胺浓度限度为 17 ppm。 目前尚无质量标准收录4-氯苯胺遗传毒性杂质含 量测定方法。本文建立了一种采用单四极杆液质联用 仪LCMS-2050 定量检 测 扑热息痛中遗传毒性杂质4-氯 苯胺的分析方法。LCMS-2050标配加热 DUIS 源，灵 敏度高、耐用性好、节省 空 间、操作简单 、维护方便，适合用于药物杂质的定性定量分析，可显著提高分析 效率。 本实验采用岛津高效液相色谱质谱联用仪 LCMS -2050。具体配置为： 系统 控 制器 SCL -40脱气机 DGU-405引：输液泵 LC -40B XR 自 动 进 样 器 SIL -40 XR 柱温箱 自：CTO-40C 二极管 阵 列检测器 SPD-M40质谱 仪：：LCMS-2050色 谱 工 作 站 ：LabSolutions Ver.5.114 图1 高效液相色谱质谱联用仪 L C M S-2050 1.2分析条件 液相色谱条件 色 谱 柱：S Shimadzu Shim-pack Velox SP-C18 100 mm x 2.1 mm l.D.，1.8 um； P/N： 227-32001-03；岛津 (上海))实 验器材有限公司 流 动 相 A-0.1%乙 酸 水溶液；B-0.1%乙酸甲醇溶液 流速 页：0.4 mL/min 柱 温品：：40°℃ 进样体积： 2uL 检测波长：254nm 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓 度 为10%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 10 2.30 Oven CTO.RVR 1* 4.50 Pumps Pump B Conc. 90 5.00 Pumps Pump B Conc. 90 5.01 Pumps Pump B Conc. 10 8.00 Controller Stop 注：*“1”表示流 路 切换至质谱。 质谱条件 采样周期：0.3sec 1.3标准溶液配制 取4-氯苯胺标准贮备液(100mg/L)，以50%甲醇水逐级稀释为 1、2、5、10、20、50、100、200、500 ug/L 的九个标准系列 工 作溶液，待测。 1.4样品前处理 准确称取扑热息痛片(规格：每片含扑热息痛0.3g) 粉末样品(含扑热息痛 10.0 mg) 至 10 mL容量瓶 中 ，加入50%甲醇水溶液，摇匀至样品溶解，定容至刻度，过 0.22 um 尼龙滤膜后，上机分析。 结果与讨论 2.1色谱条件选择 本实验针对扑热息痛片剂进行遗传毒性杂质分析，主药(扑热息痛)的 浓度约为 mg/mL级别，遗传毒 性 杂 质浓度约为 ug/L级别。为了准确测定低浓度的遗传毒性杂质，并且避免高浓度的主药和辅料进入质谱，造成污 染，需要通过流路切换阀将此类物质切至废液，只让待测杂质进入质谱检测，故主药及辅料与待测杂质的分离 度至关重要。本文对流动相组成和梯度时间程序进行了优化，优选的乙酸流动相体系以及缓和梯度时间程序，实现了主药等与待测杂质的良好分离。本方法中通过设置阀切换程序将 2.3 min 以后洗脱液切入质谱进行分 析 ，其余时间切入废液。扑热息痛 样 品 PDA 色谱图和4-氯苯胺 SIM 谱图见图 2。 图2 扑热息 痛 片样品 PDA色谱图(上，主 药浓度1 mg/mL) 和4-氯苯胺 SIM 色谱图(下，4-氯苯胺浓度 1 ug/L) 2.2专属性 溶剂 空 白样品与 4-氯苯胺标准溶液(1 ug/L) SIM 重 叠谱图 显 示，目标峰保留时间处，未见明显干扰，方 法专属性好。 图3 4-氯 苯胺标准溶液(1ug/L)和溶剂空白的重 叠 色谱图(基线移位模式) 2.3线性关系 按照1.3配制九个不同浓度的标准系列溶液，按照1.2中的分析条件进行测定。以峰面积为纵坐标，以浓度 为横坐标，外标法绘制校准曲线。4-氯苯胺校准曲线见图4，线性方程、相关系数和定量限见表2。 图444-氯 苯胺校准曲线 表2线 性 关系和定 量 限(权 重 ：1/C) 名称 线性范围(ug/L) 准确度(%) 相关系数r 定量限(ug/L) 定量限 S/N 4-氯苯胺 1~500 93.7~105.3 0.9994 1 20.6 2.4精密度实验 对三个浓度的标准溶液连续6次进样，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的精密度结果如表3所示。三个浓度标准品的保留时间和峰面积 的 RSD 分 别 在 0.05~0.07%和0.37~1.26%之 间，仪器精密度良好。 表3精 密度结果 (n =6) 名称 RSD% (2 ug/L) RSD% (20 ug/L) RSD% (200 ug/L) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 4-氯苯胺 0.07 1.26 0.05 0.83 0.05 0.37 2.5加标回收实验 在扑热息痛片样品中添加三个不同浓度的标准溶液，加标回收结果见表4。所测扑热息痛片样品中未检 测 出 4-氯苯胺杂质，色谱图见图5。三个不同浓度加标回收率在93.1~97.4%之间。 图5 扑热 息 痛样品 (1mg/mL) 和加标样品(4-氯 苯胺加标浓度 2 ug/L) 重叠色谱图(基 线移位模式) 表4 样品加标回 收 率 化合物名称 样品测定结果 (ug/g) 回收率/% 2ug/g 20 ug/g 200pg/g 4-氯苯胺 N.D. 93.1 95.4 97.4 注 ： N.D.表示未 检 出。 2.6残留实验 高浓度标准样品(500 ug/L)：分析完成后，进样分析溶剂空白，分析结果与定量限(1ug/L)比对，残留考 察结果表明，4-氯苯胺检 测 通道中无干扰。 图6 残留考察溶剂空白样品和定量限(1ug/L)重叠色谱图(基线移位模式) 结论 本文建立 了 一种使用高效液相色谱质谱联用仪 LCMS -2050 定量测定扑热息痛片中4-氯苯胺遗传毒性杂质的 新方法。本方法线性 范 围宽、灵敏度高、重复性好、准确度高、前处理简单，可 实 现扑热息痛中痕量遗传 毒性 杂质4-氯苯胺的高灵敏度、快速检测。 岛津应用云