蛋白中分子量检测方案(凝胶色谱仪)

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水溶性的蛋白-蛋白复合物 耶尔森鼠疫杆菌的ⅢI型分泌系统是一个多蛋白结构，可将细菌的致病因子注入到宿主的吞噬细胞内。这是鼠疫发病机理的一个重要组成部分，使得其能够避开哺乳动物的免疫防御系统。耶尔森鼠疫杆菌的Ⅲ型分泌系统由基底结构和中空的针状结构组成，二者一起嵌入到细菌外膜内。在与吞噬细胞的特异性粘附和对接中，ⅢI型分泌系统将分泌一组抗宿主免疫效应的蛋白即耶尔森鼠疫杆菌外膜蛋白 YOP，并注入到宿主细胞内，该蛋白可以防止细菌的吞噬并阻断促炎细胞因子的正常产生。 目前已知的基因调控致病因子的方法，包括高温诱导和 Ca离子抑制，温度37度时，通过溶液稀释使得 Ca 离子浓度低于毫摩尔每升时，致病因子(低钙响应因子Lcr)的产量增加。科学家提出了分子门户的概念，基因表达产物 LcrG 和 LcrV 是组成分子门户的一个重要部分，它可以控制YOP 的流出，且仅当与宿主细胞成功对接之后才允许 YOP 的释放。门户转运 YOP 的生化机制还没有完全弄清楚，但有建议称与 Ca 离子有关。 分析型尺寸排阻色谱与多角度激光光散射仪联用(SEC-MALS)测定样品的绝对分子量，结果表明在37度下，每一组成蛋白的分子量都与预测的一致，包括纯化后的 LcrV 单体和二聚体。 将等重量的 LcrG 和 LcrV 二聚体混合，SEC-MALS 表明与单个组分 (peak2 和 peak4)相比，有大量的 48KD 的异二聚体 LcrG-LcrV产生(图2，蓝色曲线， peak3)。 尽管 LcrG 打破了共价二聚体 LcrV (paek2)的平衡，但我们并没有检测到单体 LcrV 的存在，而且过量的 LcrV形成了三聚体 (peak1)。有意思的是，5mMCaCl2的存在，抑制了异二聚体LcrG-LcrV(红色和蓝色曲线中的 peak2 和 peak3)的产生。尽管LcrG(peak4) 摩尔数过量，但是 LcrV (peak2)依然是二聚体，很显然在这些条件下没有发生反应。这也表明，通过控制组分平衡中的极限值变化，试验中参与的因素或者没有列出的条件，可以改变共聚体的形成。 本研究借助 SEC-MALS 系统直接测定样品的绝 图1.纯化后的毒性蛋白单体的 SEC-MALS分析叠加图。红色曲线是纯化后的 LcrG；蓝色曲线是纯化后的LcrV 单体，绿色曲线是纯化后的 LcrV 二聚体。左边的y轴，代表的是摩尔质量，右边的y轴，代表的是示差折光率以及色谱峰的相对浓度。X轴代表洗脱时间，粗线代表的是每一个峰对应的分子量(斜体)： 图2.溶液组成不同形成的多蛋白复合物的SEC-MALS 结果比较。蓝色曲线，流动相不包含 CaCl2，红色曲线，流动相包含CaCl2。色谱峰依次编号，且标记出相应的分子量(斜体)。 对分子量，同时也允许对实验温度，溶剂的化学组成和蛋白的浓度做出调整。这些结果有助于我们去解析耶尔森鼠疫杆菌的ⅢI型分泌系统的门户作用机制，相似的 SEC-MALS 应用有助于更深入了解蛋白与蛋白的结合。