牛血清中蛋白质含量检测方案(抽提萃取)

智能文字提取功能测试中

来亨科学仪器Laiheng Lab-Equipment 微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 、实验原理 天然有机物(如蛋白质和氨基酸等化合物)的总氮量通常用微量凯氏定氮法(micro-kjeldahl method)来测定。 当被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为消化。由于消化过程进行缓慢，实验中常添加硫酸钾和硫酸铜的混合物来促进，硫酸铜是催化剂，硫酸钾可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使碳酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定。 上述过程的化学反应如下： (1)消化： 有机氮化物(C、H、O、N、P、S)+浓H2SO4→→→CO(2+H2O+NH3+SO2+H3PO4NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 (2)蒸馏：(NH4)2SO4+NaOH Na2SO4+H2O+NH： (3)吸收： NH3+H3BO4→→NH4HB4O7+H2O北京来亨科贸有限责任公司 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心：北京市通州区马驹桥景盛二街33号4号4层 (4)滴定：NH4HB4O7+HCL-→ NH4CL+H3BO4 在微量凯氏定氮法中，常用硼酸-指示剂混合液收集氨，氨与溶液中氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度，即指示剂变回原来颜色为止。所用无无酸的摩尔数即相当于样品中氨的摩尔数，本法适用范围约为0.2~1mg氨. 因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 二、实验用品 (一)器材 (1)微量凯氏定氮仪。 (2) 50ml凯氏烧瓶，100ml锥型瓶，50ml酸式滴定管，100ml量筒，100ml容量瓶，100ml烧杯，酒精灯。 (二)试剂 (1)无水乙醚(AR) (2)粉末硫酸钾-硫酸铜混合物： K2SO4：CuSO4.5H2O=3：1、6：1或10：1。 (3) 40%(W/V) NaOH溶液。 (4)4%(W/V)硼酸溶液。 (5)0.01mol/L主准盐酸(用硼砂标定)：吸取分析纯HCL(比重1.19，约12mol/L) 8.5ml ，用蒸馏水稀释至1L ，贮于试剂瓶中待标定。准确称取3份干燥的硼砂每份0.381~0.383g分别放在150ml三角瓶中，加入 20ml蒸馏水使其溶解，加入3滴甲基红指示剂(0.1g甲基红溶于250ml水中)，用待测的盐酸滴定至橙红色为止，记下盐酸的滴定体积，通过计算即可知道盐酸的准确浓度： (三)材料 北京来亨科贸有限责任公司 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心：北京市通州区马驹桥景盛二街33号4号4层 豆浆(市售)。 三、实验程序 (一)操作方法 1.样品的消化 在凯氏烧瓶中加入催化剂约 50mg，用移液管依次加入3mL均一的豆浆和3ml浓硫酸(移液管要接近凯氏烧瓶底部，不使样品粘附在瓶口或瓶颈)。另取取支凯氏烧瓶加入3ml水代替豆浆，其余试剂同上，此为空白。 2.仪器的装置和蒸洗 按图9-1装好凯氏定氮仪，再用蒸气进行蒸洗，以除去NH3和其他干扰物质。蒸洗方法如下： 将凯氏烧瓶放在通风柜内的电炉上加热，火力不要太猛，应以使液体保持微沸状态为宜。瓶内液体逐D-渐由黄色变为黑色，继而转为淡黄色，最后成清澈蓝色溶液，消化即告完全，取A出烧瓶，冷却，将瓶内液体转转至50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。 -C-GB-F-E 接通冷凝水，打开夹子(J)，往蒸馏瓶(B)内加入占球部1/3体积的清水，而后取 5ml蒸馏水从小漏斗(A)缓慢地注入反应瓶(F)，关上夹子(Ⅰ)，同时加热蒸馏瓶(B)，蒸馏反应瓶内的蒸馏水，使其沸腾产生蒸汽。产生的气体沿导管上升到冷凝管(C)，气体经过冷却从冷凝管末端(G)流入收集瓶。排 图9-11微量凯氏定氮仪装置图A.小漏斗； B.蒸馏瓶； C.冷凝管； D.人水口：E.出水口； F.反应瓶； G.冷凝管末端； H.出出口； iJ、K. 夹子 出反应瓶(F)中的液休，重复蒸洗2~3次，以便较熟练掌握蒸洗的方法。反应瓶(F)中的液体排出的 方法：样品蒸馏完毕后，继续加热使其沸腾，移开酒精灯，关上夹子(Ⅰ)，稍等片刻，由于蒸馏瓶(B)中的蒸汽较反应瓶(F)中的多，所以冷却后蒸馏瓶(B)中的压力比反应瓶(F)的低，反应瓶(F)内的废液迅速地从出样口(H)抽出到反应瓶外，随即自加样小漏斗(A)往反应瓶(F)中较快地倒入一子(K) 北京来亨科贸有限责任公司 3 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心：北京市通州区马驹桥景盛二街33号4号4层 排出蒸馏瓶中的热水，关上夹子(Ⅰ)，稍等片刻，反应瓶(F)内的液体又迅速地从出样口(H)抽出，然后打开夹子(K)排出蒸馏瓶中的热水，关上夹子(K)，打开夹子(J)，往蒸馏瓶(B)中加入1/3球部体积的清水，即可进行下一次蒸馏。仪器的安装和蒸洗过程中，应很好地掌握几个夹子的开关关系，避免漏气是实验成败的关键。 3.标准硫酸铵的测定 (1)吸取 10 mL4%硼酸溶液注入三角烧瓶，加人2滴指示剂，将其倾斜地放在冷凝管末端(G)下，使管末端插人溶液内。 (2)用移液管准确吸取 5ml标准硫酸铵溶液置于小漏斗(A)，小心打开夹子(Ⅰ)，使其缓慢注入反应瓶(H)，用1一2mL蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶(H) (3)量取 5 ml 40% NaOH溶液，置小漏斗(A)，小心打开夹子(1)，使其缓慢注入反应瓶(H)，同样用1一2 mL 蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶(H)，关上夹子(I)，避免蒸馏过程氨散失。 (4)加热蒸馏瓶(B)使反应瓶内液体开始沸腾，立即收集氨，当三角瓶中溶液由紫红色变成鲜绿色开始记时，蒸馏 5 min 后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续收集 2~3min，最后用蒸馏水把末端剩余的氨全部洗到三角瓶中，即算蒸馏完毕。排出废液，量取5 ml 蒸馏水蒸洗反应瓶一次，就可以进行第二份标准硫酸铵溶液的蒸馏工作。 (5)将收集的各瓶蒸馏液分别用 0.01 mol/L标准盐酸溶液滴定至蓝色消失，使溶液呈淡桔色为止。用标准硫酸铵溶液连续测定3次，3次测定的终点颜色应一致，滴定数据差值不超过±0.05ml. 4.样品及空白的测定 将3.1操作所得的消化液在定氮仪上进行含氮量测定，方法与标准硫酸铵溶液测定相同，并进行空白测定。 5.结果处理 北京来亨科贸有限责任公司 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心：北京市通州区马驹桥景盛二街33号4号4层 (A-B)xCx14 xN样品含氮量/mg·m= V， 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则 V 式中：A为滴定样品用去的盐酸平均mL数，B为滴定空白用去的盐酸平均 mL数，V为样品的ml数，C为盐酸的准确摩尔浓浓，14为氮的相对原子质量，6.25为系数，N为样品的稀释倍数。 按上面公式计算每mL标准(NH4)2S04溶液的含氮量(mg/mL)和每mL 豆浆蛋白质含量(mg/mL)。 北京来亨科贸有限责任公司 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心：北京市通州区马驹桥景盛二街33号4号4层 Folin-酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质含量一、实验原理       蛋白质含有两个以上的肽键（—CO—NH）,因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与CU2+  形成络合物。Folin-酚试剂反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂（磷钼酸-钨酸试剂）,蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。       本法的优点是操作简便、灵敏度高、较此外吸收法灵敏10~20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。对双缩脲反应发生干扰的基团，Tris.HCL缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化合物，酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。在测试时应排队干扰因素或做空白实验消除。含硫酸铵的溶液只需加浓Na2CO3-NaOH溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须将Na2CO3-NaOH溶液的浓度提高1~2倍。   本法可测定范围是25~250μg蛋白质。          二、实验用品（一）器材 （1）722型分光光度计。        （2）恒温水浴锅。        （3）试管及试管架。        （4）0.5ml，1ml及5ml移液管（二）试剂   （1）试剂甲。   （A）4%Na2CO3溶液；    （B）0.2mol/LNaOH溶液；     （C）2%酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸钠）；             （D）1% CuSO4.5H2O溶液；     临用前将（A）:（B）:（C）:（D）=50:50:1:1(体积比)混合，此混合液即为试剂甲。混合后的溶液1d内有效。（2） Folin-酚试剂(试剂乙)：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠（Na2WO4.2H2O），25g钼酸钠（（Na2MoO4.2H2O），及700ml蒸馏水，50ml 85%磷酸，100ml浓盐酸充分混合，烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出，接上回流冷凝管以文火回流10h。回流结束后，加入150g硫酸锂（LiSO4）,50m重蒸水及数滴液溴，开口继续沸腾15min，以除去多余的溴。冷却后溶液呈金黄色（如果仍呈绿色，须再重复滴加溴水的步骤），定容至1L，过滤，滤液置棕色瓶中保存，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用标准NaOH滴定酸度，以酚酞为指示剂。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度使用，即为Folin-酚试剂。（3）标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，再根据其纯度配制成500μg蛋白/ml溶液。（三）材料     血清使用前稀释100倍或约含20~250μg蛋白/ml溶液。三、实验程序（一）操作方法 1.蛋白浓度标准曲线制作    取14支试管，分两组按表9-1平行操作。