大鼠血浆中艾塞那肽检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA14-130Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-192 咨询电话：021-22013542上海市淮海西路570号红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 测定大鼠血浆中的艾塞那肽 LCMSMS-192 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定血浆中艾塞那肽的方法。该多肽化合物的线性良好，判定相关系数大于0.993；重复性实验结果表明：其保留时间和峰面积相对标准偏差分别为0.03%和4.21~4.67%之间，仪器精密度良好；其仪器检出限为 0.01 ng/mL，定量限为 0.03 ng/mL；样品加标相对回收率在30.4~34.8%之间。该方法在血浆基质中灵敏度高分析速度快可以快速、灵敏地测定大鼠血浆中的艾塞那肽。 关键词：艾塞那肽血浆超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪 糖尿病，尤其是Ⅱ型糖尿病是威胁人类健康的重大疾病，传统的治疗药物磺酰脲类和双胍类不仅副作用较大，而且对某些患者治疗效果有限；人体分泌的胰高血糖素样肽 (GLP-1)在血糖浓度较高的情况下能促进胰岛素分泌，而在血糖正常时则无此作用，而且其很容易被体内的二肽酶降解，体内半衰期不足2分钟，因此其作为临床药物使用受到了限制。后来人们发现一种从墨西哥巨蜥蜴的毒液中分离得到的含39个氨基酸的多肽艾 塞那肽与胰高血糖素样肽具有同源性，而且有同样的促胰岛素分泌的功能，稳定性好，在Ⅱ型糖尿病治疗方面具有良好的临床应用前景。 由于该类多肽药物的市场前景及由此带来的巨额利润，目前国内多家制药企业对此进行了多类剂型的仿制药的研发。为了满足用户对此类药物快速、高灵敏度的要求本文建立了一种快速灵敏的大鼠血浆中艾塞那肽的检测方法。 1.1 仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A与三重四重杆质谱仪 LCMS-8050联用系统。具体配置为 LC-30ADx2(输液泵)， DGU-20A5R(在线脱气机)， SIL-30AC(自动进样器)， CTO-30AC(柱温箱)， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8050三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.60 SP2 色谱工作站。 乙腈流速：0.40 mL/min 1.2分析条件 色谱柱： Inertsil Sustain GISS C18 Column(2.1 mm I.D.x100 mm L.， 1.9 um) 洗脱方式：梯度洗脱，初始比例10%B 流动相：A相：(0.3%甲酸+1mM乙酸铵)水， B相：(0.3%甲酸+1mM乙酸铵) 表1通用梯度洗脱程序 Time (min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 10 3.50 Pumps Pump B Conc. 85 5.50 Pumps Pump B Conc. 85 5.51 Pumps Pump B Conc. 10 8.50 Controller Stop 质谱条件 接口温度：300℃ 分析仪器： LCMS-8050 离子源： ESI+雾化气流速：3.0L/min 加热气流速：10.0L/min DL 温度：150℃加热模块温度：400C干燥气流速：10.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)， MRM 参数见表2 表2化合物信息及MRM参数 序号 化合物 英文名 CAS 前体离子 产物离子 Q1Pre CE Q3Pre Bias(V) Bias(V) 1 艾塞那肽 Exenatide 141758-74-9 1047.60 396.10 -40.0 -40.0 -19.0 299.20 -40.0 -54.0 -30.0 *表示定量离子 1.3样品制备 标准溶液配制：用甲醇配制5 mg/mL 的混合标准贮备液，用乙腈+水溶液+0.2%BSA(V/V/M， 80：20：0.2)逐步稀释成4、20、40、200、400和 800 ng/mL 系列浓度的混合标准工作液。 样品前处理方法：取空白SD大鼠血浆100 uL加入10 uL标准溶液，再加入290 uL纯乙腈，振荡后高速离心取上清。 结果讨论 2.1标准样品扫描质谱图 图1艾塞那肽全扫描质谱图 图22.艾塞那肽产物离子扫描质谱图 2.2基质加标样品的 MRM 色谱图 基质加标样品的 MRM 色谱如图3所示。 图3基质加标样品的MRM色谱图(0.1 ng/mL) 2.3线性关系 配制浓度为0.1、0.5、1、5、10和20 ng/mL的基质加标工作液，按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作校准曲线，标线如下图所示。在 0.1~20 ng/mL 浓度范围内线性良好。线性方程、线性范围和判定系数见表3。 图4标准工作曲线 表3艾塞那肽校准曲线参数 编号 名称 校准曲线 线性范围 ng/mL 准确度(%) 判定系数r² 1 艾塞那肽 Y=(7123.10)X+(359.992) 0.1~20 86.2~110.4% 0.9931 2.4检出限和定量限 对浓度为 0.5 ng/mL 的基质溶液进样分析，艾塞那肽的最低检出限(S/N=3， LOD 表示)、最低定量限 (S/N=10，LOQ表示)结果如表4所示。 表4艾塞那肽的检出限和定量限 编号 名称 检出限(ng/mL) 定量限(ng/mL) 1 艾塞那肽 0.01 0.03 2.5重复性实验 对二个浓度的混合标准溶液连续6次进样，考察仪器的重复性，保留时间和峰面积的重复性结果如表5所示。2个浓度标准品的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.03和4.21~4.67%之间，仪器重复性良好。 表5保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 编号 化合物 RSD% (0.5ng/mL) RSD% (5ng/mL) R.T Area R.T Area 1 艾塞那肽 0.03 4.67 0.03 4.21 2.6回收率和专属性实验 大鼠血浆按照1.3方法进行处理获得浓度为 0.5、5 ng/mL的样品各三份；另取适量大鼠血浆加入纯乙腈(V/V， 1：3)振荡后高速离心，取上清加标准品配制成0.5、5 ng/mL 的样品各三份。以前加标样品测得的峰面积为A，后加标样品测得的峰面积为A1测定相对回收率，回收率=A/A1。具体结果如表6，回收率在30.4~34.8%之间。比较基质加标色谱图和空白基质色谱图可知该分析方法专属性良好。空白基质的色谱图如图4所示，样品的色谱图如图5所示。 图5空白基质色谱图 图6力加标回收色谱图(0.1 ng/mL) 表6加标样的回收率结果(n=3) 浓度水平 浓度(ng/mL) 平均回收率% 1 0.5 30.4 2 5.0 34.8 2.7样品残留考察 根据药品非临床药代动力学研究指导规则要求， 在20 ng/mL 的样品分析完成后对空白样品进行分析，结果如表7所示。残留面积和定量下限 0.1 ng/mL 的面积比为7.2%，小于药品非临床药代动力学研究指导规则的20%的要求。该方法符合标准要求。 表7残留考察结果 样品类型 峰面积 面积比% 空白 68 7.2 定量下限 952 结论 使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定大鼠血浆中的艾塞那肽。该多肽化合物的线性良好，判定系数大于0.993；其仪器检出限为0.01 ng/mL， 定量限为 0.03 ng/mL；样品加标相对回收率在30.4~34.8%之间，样品残留结果符合药品非临床药代动力学研究指导规则要求。 此方法快速、简单、选择性强和灵敏度高，满足艾塞那肽体内药物分析要求，，可作为血浆中艾塞那肽的有效检测方法。 田岛津全球应用技术开发支持中心 使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定血浆中艾塞那肽的方法。该多肽化合物的线性良好，判定系数大于0.993；重复性实验结果表明：其保留时间和峰面积相对标准偏差分别为0.03%和4.21~4.67%之间，仪器精密度良好；其仪器检出限为0.01 ng/mL，定量限为0.03 ng/mL；样品加标相对回收率在30.4 ~ 34.8%之间。该方法在血浆基质中灵敏度高分析速度快可以快速、灵敏地测定大鼠血浆中的艾塞那肽。