蛋白质中电镜负染色检测方案(离子溅射仪)

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广州竞赢化工科技有限公司 本文中所用到的 ted pella 的设备耗材如镀膜仪、铜网、辉光放电仪等等在本公司官网均有售卖。如有兴趣可电话联系。 1.电镜铜网镀碳前的准备 1. 在个大玻璃杯里装满蒸馏水. 2. 用玻璃移液器吸一滴火棉胶(~20ul，2%乙酸乙酯， EMS， PA，USA)，火棉胶会在水表面铺展开，形成一层薄薄的塑料层。备注：滴一滴火棉胶的目的是去除水表面的灰尘。去掉塑料膜后，水表面就干净了 3. 将从 Ted pella 购买的 400 目或200目铜网一个接一个的铺在水面的塑料层上，一般铺 50~100个。铜网的光滑面朝塑料层。备注：对应负染色电镜铜网，400目比较合适，而对应收集倾斜双图像时，200目比较合适。 4. 剪一张比铜网所占面积大一些的纸，小心的将其铺在铜网上，直到纸张全部浸湿。备注：不同的纸的吸水率不一样，重要的是纸的吸水速度不能太快。例如，滤纸由于吸水速度太快，并且有很多皱纹，所以就不是很适合这个实验。由皱纹多的纸所制出的碳膜不平整，对应收集随机锥形倾斜3D 结构重建的倾斜双影像就不是很好。所以，实验员要测试不同的纸，找出吸水率最适合的。 5. 在靠近湿纸的地方将塑料膜切一个口子，并迅速用镊子将湿纸和塑料膜裹着的铜网夹起来，放在培养皿中，铜网面朝上，自然干燥。 2.铜网镀碳膜 1. 镀碳仪用的是从 Ted pella 购买的208C 镀碳仪，仪器配备了膜厚测控仪，测量膜厚的原理是：石英晶体上膜质量的改变，会造成石英晶体振动频率的改变，所以通过测量石英晶体振动频率的该变量，就可以算出膜质量的变化量，从而得出膜厚。然而，这个实验可以不需要膜厚测控仪。 2. 用碳棒切削器 (Ted pella) 将碳棒削尖，并装在镀碳仪上。两根碳棒夹紧，一一根尖的，一根平的。 3. 在载玻片的半边涂上真空油脂，并放在铜网旁边。注意：涂有真空油脂的载玻片在镀碳之后不会变色，通过对比两者的颜色可以估测碳膜的厚度。 4. 将粘有铜网的纸放在镀碳仪中，将载玻片放在铜网旁边。在镀碳前，你也可以将粘有铜网的塑料膜放在载玻片上，以免铜网从纸上脱落。 5. 抽真空，直到真空达到 105 Torr. 备注：低真空镀膜通常会产生大量火花，蒸发出的碳颗粒很大。 电话：020-38844987、38843619 传真：020-38843677 网址： www.gzjy17.com 6. 慢慢调大电流，碳棒的尖端会由红变白。不要用眼直视蒸发尖端。镀碳开始后，停止增大电流。玻片的颜色会由白变浅灰，再变深灰。达到所需厚度后，关掉电流。 7. 真空腔放气后，取出已镀碳的铜网。碳膜的厚度一般在 3~7nm 比较合适。 这样制出的铜网有一层塑料膜，不适合冷冻电镜。 这种塑料膜可以用三氯甲烷清洗掉。 3.准备0.75%铀酸盐溶液用于负染色电镜。 1. 称 37.5mg 铀酸盐放在一根小杯中； 2. 加入5ml开水，在暗室中搅拌5分钟； 3. 加10ul 5M NaOH，再搅拌5分钟； 4. 用滤膜过滤这些溶液，然后将溶液存放在8ml的试管中，用铝箔盖好； 提示：铀酸盐可以从 EMS 购买，货号为22451.铀酸盐溶液对光敏感，应该放在避光的地方。备好的新鲜染色液为淡黄色，在使用前可存放1~2周。甲酸铀为酸性， PH值约为4.加入 NaOH可提高 pH 值，但如果增加速度过快或过量，则会产生沉淀物。除了做染色用，铀酸盐还可以作为固定剂，来固定蛋白样品。 5. 准备负染色电镜铜网的方法 1. 利用PELCO 的 easiGlow 辉光放电仪对镀碳铜网进行放电处理，在15mA的情况下放电30秒。提示：铜网经放电处理后应尽快使用，我们一般在2小时内就使用。 2. 滴两滴20uL 的蒸馏水和2滴25pL的铀酸盐在石蜡膜上； 3. 用防毛细管吸附的镊子夹取一片放电处理后的铜网，碳膜朝上。提示：非常有必要用防毛细管吸附的镊子，否则液体样品会被镊子的毛细管吸附力吸走。 4. 放2pL蛋白样品在放电处理后的铜网上，等待30秒。提示：等待的时间和放电的时间会影响吸附在铜网上蛋白的浓度，样品越稀释，所需吸附时间越长。 5. 用滤纸吸掉样品 6. 触动铜网表面，用滤纸吸掉水滴，然后同样吸掉第二滴水。 7. 轻轻的触动粘有第一滴染液的铜网表面，再用吸掉吸掉染液，同样处理掉第二滴。 8. 在真空下干燥铜网。 5.透射电镜 1. 这里用的电镜是 FEI 的 Tecnai T12电镜，配有 GATAN 的 4Kx 4K CCD 相机。2. 在放入样品前，简单检查一下电镜的校准。 3. 将铜网装在单倾斜标准样品座上。 4. 将样品座放入电镜，等待抽完真空。 5. 将样品座推入阵列中。 6. 设定所需的散焦，通常为-1.5um。 7. 用CCD 相机记录图像。 8. 在负染色蛋白样品的相片中，蛋白一般为白色的。 6.典型例子 Figure 1.用于电镜负染色的铜网镀膜前的准备.A)将铜网一个挨一个的放在塑料膜表面B)轻轻的放上一张纸 C) 等纸张全部浸湿 D) 将附有铜网的纸取出，在空气中干燥。 Figure 2. 在铜网上镀碳膜.A)安装好碳蒸发源B)涂一点真空油脂在玻片的一边 C)开始镀碳膜D)镀膜后，涂有真空油脂的部分颜色不变 Figure 3. 负染色程序的说明.A)新鲜的(左)铀酸盐溶液是透明的，没有沉淀物。1~2周后，沉淀物就会慢慢在试管低端聚集B)滴2滴蒸馏水和2滴甲酸铀在石蜡膜上，并用防毛细管吸附的镊子夹住一个放电处理后的镀碳铜网，碳膜朝上。滴一点样品(约2ml)在铜网上。C)30秒后，用滤纸吸掉溶液 D) 翻转网格用网格的样品侧吸掉水滴。重复步骤Ｃ和D来完成染色过程。 Figure 4.负染色蛋白样品的电镜图片.A)马脾铁蛋白，B)抗原结合片段(Fab)， C) 生谷菌20S 蛋白酶 D)细胞核小体。所有的图片都是在相同放大倍数下拍摄，基准尺为20nm 电话： 传真： 网址： www.gzjycom 镀膜仪在蛋白质负染色制样中的应用案例