抗体中流体力学半径、构象、稳定性、聚集态检测方案(激光粒度仪)

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高通量动态光散射对预制剂的研究 动态光散射是一种非入侵非干扰的测量蛋白和粒子流体力学半径大小分布的方法，它的测量范围广泛，对于基于比色皿的动态光散射仪器，它的测量范围为0.2-2500nm，对于高通量动态光散射，它的测量范围为0.5-1000nm。动态光散射最基本的能力是它可以测量各种条件下的蛋白大小，构象，和聚合、齐聚状态，允许用户严格调查候选药品的行为概况。 动态光散射的测量不依赖于模糊不清的、像内在或外在荧光的报告信号，或者放热和吸热过程，这些一切可能会导致失败推测这些对稳定有实际意义的构象变化。另外，动态光散射可以直接推测真实的构象物理变化和聚集状态。 动态光散射提供了对候选生物药制品和配方的深入了解 ，包括： •从纳米粒子的聚集到亚微米颗粒聚集 在施加压力之前和之后。 在热力学压力加速的过程中。 在PH压力下。 •稳定性和聚集倾向研究 胶体稳定性、自相关性，通过浓度依耐性。 热力学构象稳定性，通过温度坡道。 化学变性构象稳定性，通过变性温度 。 •高浓度蛋白配方的粘度 传统的基于比色皿的手工动态光散射测量，只适合于少量的样品测量而不适合于成百上千的样品测量。自动化技术帮助我们解决了分析成百上千的样品和条件所面临的困难。高通量动态光散射实验改善了统计，允许多次重复，并且只需要人工分析很少一部分的时间。鉴于每个微孔数据的生成只需要10秒的时间，一个由不同样品、PH值、离子强度、重复样品覆盖384样品微孔的实验只需要90分钟就可以完成。 Dynapro Plate reader Ⅱ 使用工业标准微孔板，与其他基于板的扫描技术相兼容。实际上，这意味着，动态光散射样品易于放入其他仪器做多元样品分析。这种能够迅速检测一种药物产品在成百上千种不同条件下的性能的能力，使得科学家们更容易实施DoE和QbD试验方法，以满足监管和企业生产效率的期望。 以下例子阐明了自动化高通量动态光散射在一些基础聚合和稳定性研究中的高效率应用。 测量总体聚合 蛋白聚合是生物制药发展过程中人们主要关心的问题。未经检测的聚集降低了生物治疗的有效性，影响了药物的可制造性，并且有对病人造成严重免疫原性的风险。 图1 高通量动态光散射计量在各种条件下蛋白样品的聚集总量，显示了在冻干和复原后，含有PBS的单克隆抗体（mAb）溶液在亚微米尺寸区的聚集。 利用动态光散射监测颗粒大小分布的变化，制剂研究者就可以描绘出蛋白聚集与PH或者赋形剂浓度之间的函数关系，或者跟踪蛋白在动态温度变化过程中的聚集，或者关注制定过程中的关键航点。例如，图1，显示了使用Dynapro Plate reader Ⅱ 测量在冻干前、冻干后的两种单克隆抗体（含有蔗糖和不含蔗糖）颗粒的尺寸分布。冻干的样品被恢复为相同浓度的预冷动溶液。 在冷冻之前，两个样品的尺寸分布都是单峰，含有蔗糖的预冷动样品（图1，红线），有一个稍小的峰宽分布，这意味着小的蔗糖分子造成了一些多分散。显然冷冻过的Mabs含有更大的聚集体，含有PBS的样品在冷冻过之后会形成极大的物质。（图1 绿点线）。 尽管冷冻过的样品的聚集峰的尺寸在50到200nm，但这些聚集体的数量很小。用动态软件将这些数据转化成质量百分比，显示出尽管冷冻抗体的主体峰是位于4—10nm，其积分峰面积仅为80%，它的质量百分比却为99.6%。在50到200nm范围的聚集体，仅为蛋白总量的0.4%。是否百分比会下降在一个合适的范围，与样品有关；高通量动态光散射的作用是迅速为制剂研究者提供做出决定所需的信息。 图2 DYNAMICS展示的热图可以被划分为不同的尺寸分布，将不同程度的聚合一目了然的可视化，数据来自萨滨疫苗研究所。 样品板内的几十或几百个的样品的聚集行为的迅速可视化能够通过热图被完成，如图2所示。颜色编码被应用于区分未聚集，轻微聚集、和重度聚集的样品（分别为红色、蓝色、黑色）。这种可视化方法允许使用者能够快速获得结果概览，并在样品板上挑选出有希望进行下一步研究的特殊赋形剂、PH条件、样品分子对应的区域。 污染物和沉淀物成像 Dynapro Plate reader Ⅱ 装备有摄像头，它能被编程去获得在动态测量之后的每一个微孔的图像。相机图像的好处之一是当颗粒沉降到微孔的底部时，它可以用来辨别沉淀和结晶，如图3所示。 图3 从Dynapro Plate reader Ⅱ顶部相机得到的平面图 左边：小孔不含任何沉淀物和其他污染物。右图：小孔含有各种的污染物。 测定热力学构象稳定性 动态光散射允许制剂开发者去探测蛋白其他方面的行为，例如在动态温度范围内的构象转变。图 4 显示的是在PH 4 醋酸溶液中的溶菌酶的温度扫描。溶菌酶蛋白容易折叠或展开，没有聚集。在这种情况下，样品分子的尺寸在达到90℃平稳期之前的65℃左右开始增加，Tm表示转变的中间点，当转变无法标定中间点时，Tonset用来表示突变温度。 当溶菌酶被控制在90℃进行多个读数，它的尺寸保持不变，这说明蛋白是去折叠而不是聚集。这个行为是典型的单结构域蛋白，而不是多结构域蛋白。 此外，动态光散射系统以DLS计数率形式，固有化的并入相对静态光散射测量，使得使用者能够区分去折叠和聚集行为。静态光散射强度与分子质量成比例，分子质量在聚集时会增加，但在存粹的构象改变时不会发生变化。在溶菌酶例子中，静态光散射没有伴随尺寸的变化而变化（没有在图中展示），这个现象支持蛋白是去折叠而不是聚集的猜想。 同时测量固有荧光和静态光散射的仪器，利用紫外照明去测定聚集状态。众所周知，紫外会诱导蛋白聚集3，因而利用这种方法去分析蛋白聚集是令人高度怀疑的。Dynapro 的波长为830nm,它不会导致蛋白聚集，能够保证可以信赖的测量。 图 4：动态光散射被用于测定结构的构象转变，例如在动态温度变化下的溶菌酶的去折叠。 多结构域蛋白 lgG同时展现出去折叠和聚集现象，如图5所示。在60℃以上时，尺寸和计数率的变化是明显和聚集相关的，仔细观察温度转变点附近就能发现，不同的去折叠温度突变（58℃）点和聚集温度突变点（59℃）。温度上升的速度为0.1℃/min,因此温度滞后可能不是与时间滞后相关的动力学效应。 图5单克隆抗体在0.47mg/mL 的去折叠对聚合，由动态光散射和静态光散射测定。去折叠在聚合温度的前一度被发现，表现为与半径增加有关的静态光散射强度增强的起始点的延迟。 保持一系列的制剂在恒定的温度，并通过例子尺寸（半径）和分子质量（通过计数率）测量其聚集率，是一种测量稳定性和等级配方的有效的方式。这种稳定性化验通常应该在远低于去折叠化温度的条件下执行。高通量动态光散射支持大量样品的聚集率和制剂条件的平行测定。 在固定的温度，利用温度斜坡和加速聚集，Dynapro Plate reader Ⅱ 可以提供关于蛋白在溶液里的相互作用和由构象转变变为聚集的温度方面的宝贵见解。 测量化学构象稳定性 一种量化分子保持构象的稳定性的传统方法是化学变性梯度实验。变性剂如尿素或胍 HCl 滴定到蛋白溶液，去测定使分子折叠数量与去折叠数量一致的变性浓度，从而测定去折叠的吉布斯自由能。 在化学变性测量中，用于评估去折叠的普通方法是固有荧光。然而，动态光散射是测量去折叠的优选方法，因为它不依赖于荧光团的存在，不会导致光子引起的的破坏，它是一个通过实际尺寸变化以测定去折叠的确切、可靠的指示器。 Yu等人用Dynapro Plate reader Ⅱ演示了一种多结构域蛋白的化学变性筛选。 在研究热力学和化学构象稳定性方面，与其他技术（如固有荧光、差式量热法）相比，高通量动态光散射具有关键的优势： • 直接报告尺寸的变化，没有任何涉及判断信号是否与构象转变相关的猜测，也没有因化学环境变化导致的虚假结果。 • 直接辨别没有聚集的去折叠与聚集。 • 测定可能形成的聚集体的性质和尺寸分布，无论是可逆的或者不可逆的。 • 固有荧光被短波长的的紫外显影，而众所周知紫外会导致蛋白聚集，即使没有热量导致的变性。这个现象在抗体药物偶联物中3特别显著。 测定聚合倾向 高通量动态光散射也的、测定聚集倾向性（胶体稳定性），让使用者在早期分析阶段更好的预计稳定性，或者获得更深入的关于蛋白去折叠和聚集转变点行为信息。 图6 胶体的稳定性是表面电荷分布、局部偶极子、疏水基团、以及其他对蛋白之间作用的物理贡献的组合效应。 使用动态光散射分析胶体稳定性，制剂研究者能够测定分子在溶液中时相互之间的吸引力大小，同时动态光散射可以表明天然蛋白之间的相互作用，如图6中的图片所示。这是通过测定作为浓度的函数的扩散系数的变化得到的。如果扩散系数随着浓度的下降而下降，那么蛋白粒子正在形成更大的颗粒，出现自缔合。如果扩散系数随着浓度下降增大，那么分子倾向于相互排斥，并稳定存在于溶液中。 这些测量值通过扩散相互作用系数KD表示，它等于扩散系数比上浓度的斜率。KD值得大小与聚集倾向性直接相关。当KD大于0，排斥力占主导地位，溶液更可能呈稳定态。当KD小于0，吸引力占主导地位，样品更可能会聚集。扩散相互作用系数已经被证明是一个重要的稳定性表示系数，对于制剂研究者，可能比Tm5更有用。 图 7 显示了在特定PH的缓冲液中，以浓度为变量的3种蛋白的Rh的测量值。以浓度为变量的扩散系数的变化，被用来测定KD，同时也可以被看作是表观流体动力学半径的变化。每个样品，在每种缓冲液中，配置一系列的浓度，并将其加入微孔板进行动态光散射分析。每个蛋白样品设置24种不同的条件，每个条件下的测定重复5次，Dynapro Plate reader Ⅱ花费大概20-30分钟的时间完成测定。图8为每种蛋白以KD值对PH作图，溶菌酶和抗体在任何PH值下都是自相关的，然而BSA在PH大于7时，是稳定的。 图7 以为浓度以及PH为变量，测定的三种蛋白的流体力学半径，从流体力学半径可以得到KD。 图8 三种蛋白的相互作用系数KD作为PH的函数。 作为蛋白与蛋白相互作用的指示器，动态光散射仪利用KD去获得庞大的信息量，从而理解基于去折叠的现象的出现。图9显示了一个例子，这个例子是mAb样品的KD在去折叠转变点附近，是如何随着温度变化的。在低温时，KD和Rh相对稳定，分别大约是10mL/g 和5nm。当温度超过55℃时，由于聚集开始，Rh显著增大。在聚集温度点前几度时，Rh值迅速增大，这个现象可以被合理解释为蛋白在这个点附近时的去折叠行为。当蛋白打开后，它们的疏水核心暴露出来，蛋白分子之间产生相互吸引，KD的绝对值增大，并且KD值在聚集开始时变得更负，这意味着蛋白之间的吸引力变大。然儿，随着聚集进行，对于溶液中的其他分子，蛋白的疏水核心又变得隐藏，KD值再次变为较小的负值。 图9 因为蛋白分子开始去折叠，扩散相互作用系数KD在聚集点之前降低。 图10，在热力学转变点附近变得混乱的图9的数据，以及静态光散射的数据。蓝色的方块为KD值；黑线为Rh值；红色的圆圈为静态光散射数据；三个不同的温度转变点是显著的。为了清楚起见，KD规模被进行了修改。 仔细观察过渡区附近以及静态光散射数据，（图10），可以发现三个不同的转变温度：蛋白相互作用的起始点，在52.2℃；去折叠的起始点，在55.2℃；聚集的起始点，在57.3℃。相互作用的起始最可能是较小的构象转变引起的，构象的改变增加了分子之间的吸引力，但不足以导致聚集。 与其他稳定测定技术相比，动态光散射的关键优势是它能测定形成的聚集体的类型，和聚集度。图11展示了在高温条件下，两种不同PH环境中形成的差异很大的聚集体。 图11 通过归一化得到的在80℃的尺寸分布。左边，PH 9.5，聚合物尺寸为18.5nm；右边PH 8.5，聚合物尺寸为70nm和1000nm。 使用高通量动态光散射测定粘度 最后，动态光散射能够被用来测定制剂的粘度，从而帮助研究者确定生物制剂的长久稳定性和可运输性。动态光散射通过用具有已知直径和半径的聚苯乙烯珠填充样品孔测量粘度，如图12所示。Strokes-Einstein方程被用来计算粘度。动态光散射的结果被证明与传统的流变学技术相当吻合，例如球和椎体的粘度。使用自动化高通量动态光散射进行粘度测定的优势是，具有各种各样特征的微量体积的样品在同一个样品板上，在同一时间，可以被快速测定，向科学家对他们制剂的理解增加更多的细节层面。 图12 在动态光散射中，通过增大蛋白浓度增加溶液粘度，会导致扩散变弱，和已知尺寸的探测颗粒的半径明显增大。通过对扩散系数进行分析得到溶液粘度。 Protein Solutions 传统动态光散射测量是用比色皿一次一个样品的手动操作，因此产量和效率很低。基于比色皿的分析限制了样品和配方可以被分析的数量，限制了高效率发展策略的实施，例如质量设计（QbD）和实验设计（DoE）。自动化的高通量动态光散射联合怀雅特技术的 Dynapro Plate reader Ⅱ 帮助精简候选药物选择和预实验过程。 高通量动态光散射能够对更多的样品，更多的的配方提供更多的数据，几乎是使用比色皿进行测量的动态光散射的测量能力的10到30倍，并且只需要非常少的付出。Dynapro Plate reader Ⅱ 能够独立使用，或者作为一个自动化配方工作流程的一部分2。每个样品，仅仅需要几微升的溶液在标准微孔板里，无人值守的高通量动态光散射仪就可以大量测量各种配方，各种环境下的的生物治疗待测样品。     高通量动态光散射可以提供迅速，令人印象深刻的研究，为最终候选药物或者配方的选择提供高度的可信度。随着Dynapro Plate reader Ⅱ的21CFR11兼容软的来临，DYNAMICS SP 这个仪器可以用于需要测量生物治疗分子大小，稳定性，粘度的所有GLP和GMP实验