抗体药物偶联物中药物/抗体比率检测方案(液相色谱仪)

智能文字提取功能测试中

测定血清纯化所得的抗体药物偶联物的药物/抗体比率 应用自动亲和纯化、LC/MS分析和新型 DAR 计算软件 应用简报 前言 抗体药物偶联物 (ADC) 是一类新兴生物治疗药物，旨在通过将药物与单克隆抗体相连实现靶向给药。与小分子药物不同，ADC 不是单分子实体，而是一类异质性的抗体，每种抗体所携带的药物数量以及经历的翻译后修饰都各不相同。药物/抗体比率(DAR) 是指 ADC 偶联的药物的平均数量。 DAR 是 ADC开发过程中需要优化和密切监测的关键质量属性，因为它将影响疗效和毒性. 由于药物的释放，在血液循环中 ADC 的 DAR 将随时间变生变化。因此，制定一套测定药代动力学(PK) 研究样品中 ADC DAR 的稳定解决方案非常关键。要确定 ADC DAR，首先必须纯化血清中的 ADC， 然后使用 LC/MS对其进行分析。通常该工作流程中的样品前处理和数据分析环节需耗费大量人力，因此易受变异性和人为误差影响。 本应用简报介绍了一种用于测定血清样品中 ADC DAR 的解决方案，该方案采用 AgilentAssayMAP Bravo 平台对 ADC 进行自动亲和纯化； 将 Agilent 1290 Infinity UHPLC 与Agilent 6550 Q-TOF 质谱仪联用，用于采集准确的完整蛋白分子量数据；并利用 AgilentMassHunter BioConfirm 和 DAR 计算器软件确定 ADC 质量和 DAR。该工作流程可节省人力、降低变异性以及减少产生与 ADC DAR 测定相关的人为差差的可能性，而且仅需很少的工作量即可扩展样品处理量。 实验部分 材料重组人 HER2 胞外区(ECD) 购自 ACROBiosystems(美国特拉华州纽瓦克)。EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 和 Pierce生物素定量试剂盒购自赛默飞世尔科技公司(美国纽约州格兰德岛)。大鼠血清购自BioreclamationIVT(美国纽约州希克斯维尔)。采用安捷伦科技公司(加味福尼亚州圣克拉拉市)的 AssayMAP 链霉亲和素小柱(SA-W)。其他所有化学品均购自 Sigma-Aldrich (美国密苏里州圣路易斯)。 ADC 抗原的生物素化和固定化 采用 EZ-Link Sulfo-NHS-LC 生物素试剂盒，按照制造商提供的操作说明对 HER2 ECD进行生物素化。然后使用 Pierce 生物素定量试剂盒，按照制造商提供的操作说明测定生物素与 HER2 ECD 的摩尔比，所得结果为9.0。使用由固定化应用控制的 Agilent AssayMAPBravo 在每个 AssayMAP SA-W 小柱上固定2 pg 生物素化的 HER2 ECD。简而言之，先使用1%甲酸对 SA-W小柱(微量色谱柱，其中装填有约 5 pL与链霉亲和素共价结合的填充树脂)进行灌注和平衡，然后采用固定化应用中“Prime， Equilibrate， andInternal Cartridge Wash 1”(灌注、平衡和内部小柱清洗1)的默认设置， 使用 HEPES缓冲液(10 mM HEPES、150 mM NaCl，pH 7.4)进行清洗。取消固定化应用中的 所有其他步骤。使用1%甲酸进行灌注和平衡可排出小柱内夹带的空气，同时还能严格地清洗小柱，去除其中的链霉亲和素单体，避免它们在最终洗脱步骤的低 pH条件下从固相载体上解离。通过清洗步骤，我们得到了用于结合生物素化抗原的小柱。接下来， 以 5 pL/min 的流速向每个 SA-W 小柱上样100pL含2 pg生物素化抗原的 HEPES缓冲液，然后使用由固定化应用控制的AssayMAP Bravo， 采用 HEPES 缓冲液执行一次清洗。本实验采用了“Sample Loadand Internal Cartridge Wash 1”(上样和内部小柱清洗1)的默认设置，取消了固定化应用中的所有其他步骤。接下来，将 2 pg生物素化的 ADC 抗原偶联到每个 SA-W 小柱上，从而得到 ADC 亲和小柱。 ADC 亲和纯化 用去离子(DI)水将商购冻干 ADC复溶至1 mg/mL后分装，使用前置于-80℃下储存。将 ADC 加入大鼠血清后进行连续稀释，制备浓度分别为20、10、5、2.5、1.25和0.625 pg/mL 的ADC 溶液。将未加入 ADC的大鼠血清作为对照。在将上述样品上样至 ADC 亲和小柱之前，用 HEPES 缓冲液按1：1的比例对其进行稀释。亲和纯化步骤通过由亲和纯化应用控制的 AssayMAP Bravo执行。简而言之，该过程是以 3 pL/min 的流速将100 pL 含 ADC 的大鼠清清稀释液上样至各ADC亲和小柱(每个ADC浓度n=4)， 然后用四种清洗液(各50pL，分别为： HEPES 缓冲液、含 1 M NaCl 的 HEPES 缓冲液、0.003%甲酸和水)以 10 pL/min 的流速进行四次清洗。最后，用15pL 1%甲酸将各小柱中纯化后的 ADC 洗脱至体积固定为 15 pL的0.5%氢氧化铵溶液中，以中和经纯化的 ADC。 LC/MS分析 使用配备安捷伦双喷射流 ESI离子源的Agilent iFunnel 精确质量6550 Q-TOF(加利福福亚州圣克拉拉市) 与 Agilent 1290Infinity UHPLC 系统(加利福尼亚州圣克拉拉市)联用进行 LC/MS 分析。表1和表2列出了所采用的 LC/MS参数。从所有血清样品纯化所得的 ADC 中取 3pL (总样品体积的十分之一)进样，仅进行质谱分析；另外，分别从 ADC 浓度为 2.5、1.25和 0.625 pg/mL的血清样品纯化所得的 ADC 中取 10pL (总样品体积的三分之一)进样，仅进行质谱分析。进样100 ng 商购 ADC (n=4) 作为对照。 ( 数据分析 ) ( 使用Agilent MassHunter BioConfirm 软件 分析原始数据文件。提取 2.2-3.2 min 的谱图并计算其平均值，然后进行解卷积处理。 接下来， 采 用 Agilent MassHunter DAR 计 算器和解卷积质谱图计算各载药量下的 ADCDAR 和 ADC 百分比。表3列出了解卷积参数。 ) 表1.液相色谱参数 参数 Agilent 1290 Infinity UHPLC 系统 色谱柱 Agilent PLRP-S 1000A 8 pm 150×2.1 mm (PL1912-3802) 样品恒温 5°C 流动相A 0.1%甲酸的水溶液 流动相B 0.1%甲酸的乙腈溶液 梯度(分段) 时间(min) %B 0-0.5 25 0.5-1.5 25-35.5 1.5-3.5 35.5 3.5-5.0 35.5-50 5.0-5.5 50-25 5.5-7.5 25 停止时间 7.5 min 柱温 80 °C 流速 0.4 mL/min 表2.质谱参数 参数 Agilent 6550 Q-TOF 质谱仪 电离模式 正离子模式 离子源 安捷伦双喷射流离子源 干燥气温度 225°C 干燥气流速 14 L/min 鞘气温度 325°C 鞘气流速 12L/min 雾化器 40 psi 毛细管电压 4500 V 喷嘴 1500V 碎裂电压 250 V Oct RF Vpp 750V 采集参数 MS 模式 高(10000m/z)质量范围， 扩展质量范围(2GHz)， 仅 MS 模式， 质量范围1000-4500 m/z。 表3. MassHunter BioConfirm 参数 参数 Agilent MassHunter BioConfirm 解卷积 (MS)：蛋白质 解卷积算法 最大熵 解卷积设置 质量范围： 140-160 KDa 质谱精度： 1.0Da 使用受限的m/z范围 2000-4500 m/z 基线 扣除基线 基线因子3.50 加合物 质子 结果与讨论 我们为血清样品中 ADC DAR 的测定成功开发出了一套解决方案。该解决方案包括：在 AssayMAP Bravo 平台上使用 ADC 亲和小柱对血清中的 ADC 进行自动亲和纯化；使用1290 Infinity UHPLC 和 6550 Q-TOF质谱仪采集完整 ADC 的质谱数据；使用Agilent MassHunter BioConfirm 对质谱图进行解卷积处理，以及使用 AgilentMassHunter DAR 计算器计算 DAR(图1)。 该工作流程的第一个步骤是对血清中的 ADC进行自动纯化。为执行该步骤，我们将生物素化的 ADC抗原固定到 AssayMAP SA-W小柱上，制备了定制 AssayMAP 亲和小柱，该操作采用由固定化应用(专为定制亲和小柱而设计)控制的 AssayMAP Bravo执行。每个小柱上固定2 pg 抗原，超过本应用简报中将要纯化的最大抗体摩尔量近四倍。优化研究的结果表明，在本应用简报所采用的流速条件下，过量四倍摩尔量的抗原足以捕获目标 ADC (相关数据未显示)。流速与摩尔量过量水平相关，这两个参数均可根据具体实验设计更改。应注意的是，所用抗原量并非受 SA-W容量限制(针对本实验中的特定抗原，容量约为75 pg)， 而应该以最大限度减少实验中的抗原消耗量为选择标准。 将商购 ADC 加入大鼠血清，使其浓度达到20 pg/mL， 然后使用 ADC 亲和小柱以及由亲和纯化应用控制的 AssayMAP Bravo 进行亲和纯化。假定回收率为100%， 对100 ng商购 ADC (图2A) 和 100 ng 血清样品亲和纯化 ADC (图2B) 进行LC/MS分析，2.2-3.2 min 之间的主峰即代表洗脱的ADC。在亲和纯化 ADC的分析结果中，1-1.5 min之间出现的其他小峰代表残留的盐类，4.7-5.5 min 之间的小峰则代表大鼠血清中共纯化的蛋白，其质量数范围集中在1500 m/z左右。通过微调过的液相色谱梯度可将这些残留的共纯化蛋白彻底分离，因此它们不会对 ADC离子化造成影响。图2C 和2D表 明，两种 ADC 在 ADC 洗脱窗口中得到的提取质谱图几乎完全相同。经解卷积处理后，在商购 ADC(图2E)和亲和纯化 ADC (图2F)的解卷积质谱图中均可观察到七个峰组，它们所代表的 DAR 值分别为0-7， 其中每个峰组中有四个主峰，代表不同糖型的ADC (即 GOF/GOF、GOF/G1F、G1F/G1F或 GOF/G2F， 以及 G1F/G2F)。我们使用MassHunter DAR 计算器，利用七个峰组下的峰面积计算了 DAR。两种 ADC 计算所得的 DAR 值相似 (DAR=3.5)。上述结果表明 AssayMAP Bravo 平台的自动 ADC纯化功能可达到高回收率和高纯度。 图2.商购ADC 以及亲和纯化获 ADC 的代表性总离子流色谱图 (TIC)、提取质谱图和解卷积质谱图。 A) 商购 ADC 的 TIC。 B) 亲和纯化 ADC 的 TIC。C) 商购 ADC 的提取质谱图。D) 亲和纯化 ADC 的提取质谱图。E) 商购 ADC的解卷积质谱图(示出了 DAR 计算结果)。F) 亲和纯化 ADC 的解卷积质谱图(示出了 DAR计算结果) 为评估该工作流程对 PK 研究的适用性，我们将商购 ADC 加入大鼠血清并连续稀释至20、10、5、2.5、1.25和 0.625 pg/mL， 然后按上述操作进行纯化。另外，将不含 ADC的大鼠血清样品作为对照。上样至各小柱的血清样品中所含的 ADC 量分别为1000、500、250、125、62.5、31.25和0ng。 将每个纯化样品洗脱液的十分之一用于质谱分析进样，对应的 ADC 上样量分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125和0ng(假设回收率为100%)。图3所示为 ADC 质量数范围内(2000-4500 m/z) 的提取离子色谱图(EIC)。对 2.2-3.2 min 之间的峰进行了积分，并计算了各 ADC 浓度的变异系数(CV)。在 ADC 浓度高于 1.25 pg/mL 的血清样品中，纯化 ADC 的重现性非常出色，CV 均低于10%。请注意，对照组亲和纯化血清样品(不含 ADC) 的 EIC 基本为直线，这表明ADC 洗脱窗口中不存在共纯化蛋白。这种纯化特异性得益于 SA-W小柱极低的非特异性结合性能、ADC针对抗原的高度特异性以及经过微调的清洗条件。该工作流程无需采用表面活性剂去除共纯化蛋白。 图3.不同血清浓度的亲和纯化 ADC 的提取离子色谱图(EIC)。使用 ADC 亲和小柱和 Agilent AssayMAPBravo 分别对 50 pL 含 20、10、5、2.5、1.25、0.625和0 pg/mL ADC的大鼠血清(各浓度下n=4)进行亲和纯化。将纯化血清样品所得的 ADC 的十分之一用于各亲和纯化样品的质谱分析进样。提取出 EIC(2000-4500m/Z)。对 2.2-3.2 min 之间的峰进行积分，并计算各 ADC 浓度样品的变异系数(CV) 图4所示为分析 ADC 浓度为 20、10、5、2.5、1.25和0.625 pg/mL的大鼠血清亲和纯化 ADC 样品得到的解卷积质谱图及其相应的DAR。对于纯化 ADC 浓度为 20、10 和5 pg/mL的血清样品所得的ADC， 我们采用的是10%的上样量，由于信噪比 (S/N) 会随着所分析的 ADC 量下降而降低，因此对于纯化ADC 浓度为2.5、1.25和0.625 pg/mL的血清样品所得的 ADC， 我们采用了33%的上样量。这样可使得低 ADC 浓度的样品也能得到高质量的解卷积质谱图。实验采用的所有 ADC 浓度条件均获得了一致的解卷积质谱图和 DAR (图4，表4)。对于纯化自 ADC 浓度为 20、10、5和2.5 pg/mL的血清样品的各 ADC 样品而言，不同载药 量(D0-D7)ADC 的百分比相当，并且该百分比非常接近直接对商购 ADC 进行质谱分析所得结果。但对于纯化自 ADC 浓度为1.25和0.625 pg/mL 的血清样品的各ADC 样品而言，不同载药量 ADC 的百分比与商购ADC 分析结果的一致性稍差(表4，图5)。因此，为了提高谱图质量以及减少工作流程的检测/定量步骤所受的限制，可适当提高执行 LC/MS 分析时的洗脱液进样百分比。此外，还可以在洗脱 ADC 之前进行去糖基化处理，以简化谱图并改善信号。上述结果表明，本应用简报所展示工作流程能够在血清 ADC 浓度较低的条件下可重现地测定不同载药量的 ADC DAR 和 ADC 百分比。 ×102 ×102 图4.大鼠血清亲和纯化 ADC 样品的代表性解卷积质谱图和 DAR。使用 ADC 亲和小柱和 Agilent AssayMAP Bravo 分别对 50 pL 含 20、10、5、2.5、1.25、0.625和0 pg/mL ADC 的大鼠血清(各浓度下n=4)进行亲和纯化。对于纯化 ADC 浓度为 20ug/mL (A)、 10 pg/mL (B) 和5 pg/mL (C) 的血清样品得到的 ADC， 取10%用于质谱分析进样；对于纯化 ADC 浓度为 2.5 pg/mL(D)、1.25 ug/mL (E) 和 0.625 pg/mL (F) 的血清样品得到的 ADC，取33%用于质谱分析进样。 CADC：大鼠血清中 ADC 的浓度 各载药量下的 ADC 百分比(%) 样品 DAR DAR O DAR1 DAR 2 DAR 3 DAR 4 DAR 5 DAR 6 DAR 7 商购 (n=4) 3.50±0.02 2.11±0.75 9.9±1.08 17.35±0.33 22.82±1.69 19.88±1.81 15.35±0.47 7.97±0.93 4.65±0.77 亲和纯化自 ADC 浓度为 20 pg/mL的 3.49±0.02 2.4±0.68 9.45±1.05 17.32±0.25 23.32±1.45 20.17±1.63 14.97±0.59 7.58±0.69 4.8±0.88 血清样品(n=4) 亲和纯化自 ADC 浓度为 10 pg/mL 的 3.46±0.02 2.54±0.19 9.72±0.24 17.38±0.18 23.87±0.47 19.73±0.13 14.36±0.13 7.47±0.24 4.95±0.38 血清样品(n=4) 亲和纯化自 ADC 浓度为 5 pg/mL的 3.49±0.03 3.47±0.21 9.67±0.74 16.6±0.16 22.3±0.1 19.83±1.08 14.41±0.21 8.49+0.26 5.24±0.74 血清样品(n=4) 亲和纯化自 ADC 浓度为 2.5 pg/mL的 3.43±0.06 3.08±0.26 9.94±0.22 17.83±0.53 23.21±0.59 19.55±0.18 13.64±0.23 8.01±0.65 4.73±0.54 血清样品(n=4) 亲和纯化自 ADC浓度为 1.25 pg/mL -3.4±0.1 4.43±0.22 11.31±1.68 17.96±0.89 20.73±0.65 18.17±0.94 12.55±1.17 9.08±0.5 5.78±0.66 的血清样品(n=4) 亲和纯化自 ADC 浓度为 0.625 pg/mL 3.48±0.08 6.49±0.66 10.95±1.45 16.43±0.8 17.9±0.98 16.61±0.49 12.67±1.29 11.91±0.71 7.05±0.43 的血清样品(n=4) 图5.各载药量下的 ADC百分比 安捷伦为您提供了一套全面的 ADC DAR 测定解决方案，包括使用Agilent AssayMAPBravo 进行自动亲和纯化；使用 Agilent 1290Infinity UHPLC 和 Agilent 6550 Q-TOF 采集 LC/MS 数据； 使用 Agilent MassHunterBioConfirm 软件进行解卷积处理，以及使用Agilent MassHunter DAR 计算器确定 DAR.该 ADC DAR 测定解决方案的优势在于： 节省人力，降低变异性并减少可能引入的人为误差 提高血清 ADC 纯化操作的产率和纯度 生成高分辨率的谱图 轻松完成 DAR计算 ( 1. Perez， H. L.； et al. Antibody-drug conjugates： current status and future directions. Drug Discovery Today 2014， 19(7)，869-881. ) ( 2. Beck， A.；et al. Cutting-edge massspectrometry methods for the multi-level structural characterization of antibody-drug c onjugates. Expert Reviews of Proteomics 2016，13：2， 157-183. ) 3. Xu， K.； et al. Characterization ofintact antibody-drug conjugatesfrom plasma/serum in vivo byaffinity capture capillary liquidchromatography-mass spectrometry.Analytical Biochemistry 2011， 412，56-66. 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com/chem/bioconfirm 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年3月30日， 中国印刷 5991-6621CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 前言抗体药物偶联物 (ADC) 是一类新兴生物治疗药物，旨在通过将药物与单克隆抗体相连实现靶向给药。与小分子药物不同，ADC 不是单分子实体，而是一类异质性的抗体，每种抗体所携带的药物数量以及经历的翻译后修饰都各不相同。药物/抗体比率 (DAR) 是指 ADC 偶联的药物的平均数量。DAR 是 ADC 开发过程中需要优化和密切监测的关键质量属性，因为它将影响疗效和毒性。由于药物的释放，在血液循环中 ADC 的 DAR 将随时间发生变化。因此，制定一套测定药代动力学 (PK) 研究样品中 ADC DAR 的稳定解决方案非常关键。要确定 ADC DAR，首先必须纯化血清中的 ADC，然后使用 LC/MS 对其进行分析。通常该工作流程中的样品前处理和数据分析环节需耗费大量人力，因此易受变异性和人为误差影响。本应用简报介绍了一种用于测定血清样品中 ADC DAR 的解决方案，该方案采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台对 ADC 进行自动亲和纯化；将 Agilent 1290 Infinity UHPLC 与Agilent 6550 Q-TOF 质谱仪联用，用于采集准确的完整蛋白分子量数据；并利用 Agilent MassHunter BioConfirm 和 DAR 计算器软件确定 ADC 质量和 DAR。该工作流程可节省人力、降低变异性以及减少产生与 ADC DAR 测定相关的人为误差的可能性，而且仅需很少的工作量即可扩展样品处理量。结论安捷伦为您提供了一套全面的 ADC DAR 测定解决方案，包括使用 Agilent AssayMAP Bravo 进行自动亲和纯化；使用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 和 Agilent 6550 Q-TOF 采集 LC/MS 数据；使用 Agilent MassHunter BioConfirm 软件进行解卷积处理，以及使用Agilent MassHunter DAR 计算器确定 DAR。该 ADC DAR 测定解决方案的优势在于：• 节省人力，降低变异性并减少可能引入的人为误差• 提高血清 ADC 纯化操作的产率和纯度• 生成高分辨率的谱图• 轻松完成 DAR 计算