IgG1中二硫键检测方案(液相色谱仪)

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利用 Agilent 1260 Infinity 生物情性液相色色系统及 Agilent ZORBAX RRHD二苯基亚 2 pm 色谱柱分析IgG1中的二硫键 应用简报 生物制药 作者 M. Sundaram Palaniswamy 安捷伦科技公司 班加罗尔，印度 摘要 本应用简报报导了一种简易的反相 HPLC方法，用于分析单克隆抗体(mAb)中的二硫键。其中通过 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统及 Agilent ZORBAX RRHD300二苯基亚 2 um 粒径色谱柱实现分离。在完整蛋白质及肽段消化物的反相分离中，二苯基1.8pm 色谱柱能够提供 UHPLC 级别的性能。当与 UHPLC 仪器联用时，这种通用型色谱柱可在更短的分析时间内获得更全面的表征结果。1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统的耐压能力高达600 bar， 能够承受采用更低粒径(低至1.7 pm) 的新型色谱柱技术所要求的更高压力。 前言 虽然近年来重组 mAb 疗法取得了很大的发展，但是关于它们的二硫键模式，人们所掌握的信息很少。研究IgG1 抗体中完整的二硫键分布极具挑战性，这是由于它们的分子量很大，并且二硫键的数目很多。对于治疗性单克隆抗体(mAb)，二硫键是保持免疫球蛋白 (IgG) 三级和四级结构的关键因素。在 mAb 生产过程中，链间和链内的二硫键均在表达宿主细胞内形成，然后进行分泌和纯化。之前的报道指出，对于 lgG2 及二硫化介导的IgG4臂交换，二二硫键会发生重排，反映出这些IgG 类型的一种固有行为1.2。但是，已有报道观察到 IgG1 中的二硫键数目呈现出不规则的显著降低3，这对于治疗性mAb 生生产而言是一个很重要的问题。本应用简报证实了1260生物惰性四元泵液相色谱系统适用于 IgG1中二硫键的分离和分析，该系统采用反用 HPLC 方法和ZORBAXRRHD 300二苯基， 2.1×100 mm， 1.8um粒径色谱柱。采用亚2 pm 粒径色谱柱的超高效液相色谱(UHPLC)分离， 可改善每次分析的分离度和灵敏度，缩短分析时间，并且可用于分析 lgG1、还还态 lgG1，以及IgG1消化产生的肽段。 仪器设备 仪器 ( 具有完全生物兼容性的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统，最高耐压为600 bar，由以下模块组成： ) ( · Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相 泵(G5611A) ) ( · Agilent 1260 Infinity 生物惰性高效自动 进样器(G5667A) ) ( · Agilent 1200 Infinity 系列自动进样器恒温器(G1330B) ) ( · Agilent 1260 Infinity 柱温箱，配置生 物惰性嵌入式加热元件(G1316C， 选 项19) ) ( · Agilent 1260 Infinity 二极管阵列检测 器，配置60 mm 最大光强高灵敏度流通池 (G4212B选项33) ) ( · Agilent ZORBAX RRHD 300 二苯基， 2.1×100 m m ，1.8 um粒径色谱 柱 (部件牛858750-944) ) ( 整个样品流路中不含任何金属部件，因此样品不会接触到金属表面。溶剂输送系统中不含任何不锈钢或铁质部件。 ) ( 软件 Agilent OpenLAB CDS ChemStation， L C 和LCMS系统版， 修订版 C.01.04 ) 试剂、样品与材料 人单克隆抗体 IgG1 是一种专利性药物分子。DL-二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺、三羟甲基氨基甲烷碱完及蛋白内切酶 Lys C均购自美国西格玛奥德里奇公司。所有的化学品和试剂均为 HPLC 级，高纯水由MilliQ纯水系统(Millipore Elix 10 型，美国)制备。乙腈为梯度极，购自 Lab-Scan公司(泰国曼谷)。 完整 IgG1 的还原和烷基化 用100mM Tris HCI 和4M Gu HCI， pH 8.0将 IgG1稀释至2mg/mL。加入10pL0.5 M DTT储备液，使其终浓度为5mM。混合物在37C下反应30分钟。然后待反应混合物短暂冷却却室温。加入26pL0.5M碘乙酰胺储备液，使其终浓度为13mM。反应45分钟。移去后加入20pLDTT以淬灭反应，并使终浓度为10mM。 Lys C消化 IgG1 和还原 用 100 mM Tris HCI， pH 8.0将IgG1稀彩至1 mg/mL。加入蛋白内切酶 Lys C 的100 mM Tris HCI溶液， pH 8.0， 其中酶和蛋白质的比例为 1：100(w/w)。混合物在37°℃下孵育过夜。然后加入10% TFA将pH值降至6.0以停止反应。然后，使用本应用简报上文中介绍的方法还原Lys C消化后的 lgG1。 结果与讨论分离和检测 ZORBAX RRHD 300 二苯基 1.8 pm粒径色谱柱具有可耐受低 pH 和温度稳定性好的优势， 与耐压 600 bar以及能在更高压力下运行的 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统联用时，可用于分离蛋白质。 图1 利用 Agilent ZORBAX RRHD 300二苯基， 2.1×100mm， 1.8 pm 粒径色谱柱所得的完整 IgG1 的RP HPLC 谱图(A)， 以及六次重复的叠加图(B) 保留时间 峰面积 平均值(min) RSD(限值：±3.0%) 平均值(mAU/min) RSD(限值：±5.0%) 8.838 0.086 1，170 0.461 表2保留时间和峰面积 RSD(%)， 完整 lgG1， n=6 图1A展示了优化后完整 lgG1 的 RP HPLC洗脱图谱，其中采用了 ZORBAX RRHD 300二苯基，2.1×100mm， 1.8 pm 粒径色谱柱，证实了 IgG1在15分钟内具有优异的保留性。进行6次重复实验以检测分析的重现性。图1B为6次重复实验的叠加图。 还检测了对完整 IgG1 中二硫键进行还原和烷基化的效果。图2A展示了经过还原和烷基化后的IgG1反相色谱图，B为与还原/烷基化缓冲液空白的叠加图，C为6次重复实验的叠加图以展示分离的重现 性。由于二硫键键还原， IgG1被分为轻链和重链。 IgG1 洗脱后，存在明显的轻链(LC)和重链(HC)，如图2中所示；但是，质谱分析未能证实这一点。 图2 (A)还原和烷基化 IgG1 的 RP HPLC 谱图， (B)与缓冲液空白的叠加图， (C)六次重复的叠加图 保留时间 峰面积 平均值(min) RSD(限值：±3.0%) 平均值(mAU/min) RSD (限值：±5.0%) 8.638 0.091 504.33 2.780 保留时间和峰面积 RSD (%)， 轻链， n=6 保留时间 峰面积 平均值(min) RSD(限值：±3.0%) 平均值(mAU/min) RSD (限值：±5.0%) 9.084 0.152 1，520 0.390 表4 保留时间和峰面积RSD (%)， 重链， n=6 在未还原状态下，完整 IgG1 的 Lys C消化物所得的肽图会形成复杂程度较低的RP HPLC 谱图。IgG1 消化物的代表性色谱图(图3A)中显示了两个用于峰面积和保留时间精密度评估的峰(基线分离)。。叠加图中展示了尖锐的色谱峰，且具有良好的分离度和优越的分离重现性(图3B)。 此外，我们想要比较未还原和还原状态下IgG1的反相色谱图，以测定二硫键所连接的肽段。图4中展示了未还原(红线)和还原(蓝线)IgG1 的 Lys C 肽图的叠加图。还原后， IgG1 的 Lys C 消化物中出现了额外的色谱峰(以*号表示))，证实了它们由二硫键连接。 保留时间和峰面积的精密度 完整lgG1、还原态 IgG1 和未还原状态下蛋白内切酶 Lys C 消化后的 lgG1的保留时间和峰面积精密度分别如表2、3和4中所示。结果显示 ZORBAX 二苯基亚 2 pm色谱柱的保留时间和峰面积的精密度分别在3%和5%以内。 利用二苯基2.1×100 mm 1.8 pm 粒径色谱柱进行二硫键分析 图3 (A) Lys C 消化后 IgG1的 RP HPLC 谱图以及(B)六次重复的叠加图。用于保留时间和峰面积 RSD 检测的峰以*号标示 保留时间 峰面积 平均值(min) RSD(限值：±3.0%) 平均值(mAU/min) RSD (限值：±5.0%) 色谱峰1 5.525 0.307 60 0.544 色谱峰2 7.444 0.140 132.45 1.113 表 5 保留时间和峰面积 RSD (%)， Lys C 消化后IgG1， n=6 图4 比较未还原(红线)和还原(蓝线)状态下 Lys C 消化后 IgG1的肽图。二硫键连接的肽段以*号标示 在生物制药工艺开发和监测过程中，二硫键分析对于研究蛋白的一些翻译后修饰非常重要。我们展示了将 Agilent 1260 Infinity 生物惰性系统液相色谱系统与 Agilent ZORBAXRRHD 300二苯基， 2.1×100mm， 1.8 um粒径色谱柱联用，能够实现单克隆抗体中二硫键的可重复高分离度分析，适用于生物制药工艺开发和监测。优越的峰面积和保留时间精密度证实该方法具有可靠性。此外， 1260 Infinity 生物惰性液相色谱的耐压高达600 bar， 能够采用压力要求更高的新型小粒径(低至1.7 pm)色谱柱技术。仪器的生物惰性和抗腐蚀性加上简单和可重复的方法，使得这种解决方案特别适合用于生物制药行业中单克隆抗体的QA/QC分析。 1. ( R. Mhatre， J. Woodard， C. Zeng， Strategies for locating disulfide bonds in a monoclonal antibody via mass spectrometry spectrometry， R apid Commun. Mass Spectrom. 13 (1999) ) 2503-2510. ( 2. T.-Y. Yen， H. Yan， B.A. Macher， Characterizing closely spaced， complex disulfide bond patterns in p eptides andproteins by liquid chromatography/ electrospray ionization tandem m ass spectrometry， J . Mass. Spectrom. 37 (2002) 15-30. ) ( 3. Mullan et al. BMC P roceedings 2011， 5(Suppl 8)： P110 ) www.agilent.com/chem/bio-inert @安捷伦科技(中国)有限公司，2013 2013年2月1日，中国出版 5991-1694CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 本应用简报报导了一种简易的反相 HPLC 方法，用于分析单克隆抗体 (mAb) 中的二硫键。其中通过 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统及 Agilent ZORBAX RRHD 300 二苯基亚 2 μm 粒径色谱柱实现分离。在完整蛋白质及肽段消化物的反相分离中，二苯基 1.8 μm 色谱柱能够提供 UHPLC 级别的性能。当与 UHPLC 仪器联用时，这种通用型色谱柱可在更短的分析时间内获得更全面的表征结果。1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统的耐压能力高达 600 bar，能够承受采用更低粒径（低至 1.7 μm）的新型色谱柱技术所要求的更高压力。