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来亨科学仪器Laiheng Lab-Equipment 新鲜兔肝中碱性磷酸酶提取及比活力测定 一、实验原理 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为 ALPase)广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中, ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase 与磷的代谢直接相关,参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase 的作用最适 PH 在碱性区域,一般在 PH9.0~10.5范围内。Mg²+对该酶的活力有显著的激活使用。 为了获得好的提取效果,在酶的制备过程,特别应注意以下几点: (1) 选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始,否则应在低温下保存。 (2)用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时,要注意保持缓冲液 ( 销售中心:北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细,需缓慢加入并及时搅拌溶解,尽量防止泡沫形成,以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀,要静置20min 以上,以使沉淀完全,然后方可时行离心分离。 (3)有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作,缓慢加入,充分搅拌,避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后,最好立即将其溶于适量缓冲液中,以避免酶活力的丧失。 (4)在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大,提纯步聚才有效。 酶活力的分析:通常是以对一硝基苯磷酸二纳(pNPP)为底物,在PH10.1的碳酸盐缓冲液(含2mmol/LMg)的测活体系中检测酶催化 pNPP水解产生黄色的对硝基苯(pNP) 在 405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD405 值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下,以5mmol/L pNPP为底物,在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2mmol/LMg²+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每 mg 蛋白所具有的酶活力单位数。 蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenolreagem)显色法,详见北京来亨科贸有限责任公司技术文章。 二、实验用品 (一)器材 (1)高速组织捣粹机和玻璃匀浆器。 (2)离心机。 (3)超级恒温水浴锅。 ( 销售中心:北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) (4)酸度计。 (5)722分光光度计。 (6)天平、台秤。 (7)透析袋。 (8)磁力搅拌器。 (9)冰箱。 (10)秒表。 (11)50uL微量进样器。 (二)试剂 (1)含 0.1mol/L NaCl 的 0.01mol/L Tris HCL PH7.5 缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷 1.214g,NaCl5.8g, 溶于蒸馏水中,加入80ml 0.1mol/L HCL, 用蒸馏水定容到1000ml。 (2)正丁醇(分析纯)。 (3)硫酸铵(分析纯)。 (4)0.5%NaCl:称取5g NaCl 溶于1000 mL 蒸馏水中。 (5) 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3 pH 10.1缓冲液:分别取(A)液 70mL,(B)液30ml混匀,用酸度计准确调节 pH 10.1。 (A) 0.1 mol/L Na2CO3溶液:取 28.6gNa2CO:10H20溶于1000 mL蒸馏水中。 (B) 0.1 mol/L NaHCO3溶液:取 8.4gNaHCO3 溶于1000 mL 蒸馏水中。 (6)0.5 mol/L醋酸镁溶液:称取醋酸镁107.25 g 溶于蒸馏水中,稀释成1000ml。 (7) 0.1 mol/L醋酸钠溶液:称取醋酸钠8.2g溶于蒸馏水中,稀释至1000 ml. (8) 0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液:取0.5 mol/L醋酸镁20ml醋酸钠100 mL,混匀北京来亨科学仪器有限公司 3 ( 销售中心:北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 景盛南二街33号4号楼4层 后加蒸馏水稀释至1000 ml. (9) PH8.8 Tris.HCI缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1g, 用蒸馏水溶解。并稀释至1000ml,即为 0.1 mol/L Tris 溶液。取 0.1 mol/L Tris 溶液100mL, 加蒸馏水约800ml, 再加 0.1 mol/L 醋酸镁100 mL, 混匀后用1%醋酸调节 pH至8.8,用蒸馏水稀释至1000ml即可。 (10) 丙酮(分析纯)。 (11)95%乙醇(分析纯)。 (12) 20 mmol/L Mgcl2:称取 1.904 g Mgcl2溶于 1000ml蒸馏水中。 (13)0.1mol/L NaOH:称取 4g NaOH 溶于 1000ml蒸馏水中 (14)20 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠(pNPP):称取 371.2 mg pNPP 溶于50ml蒸馏水中。 (15)底物溶液(5mmol/LpNPP):按以下比例混句(5):(6):(8):H2O=l:0.2:0.50:.28. (16)0.5umol/mL对硝基苯酚 (pNP=141.1)溶液:精确称取 17.64mg对硝基苯酚,用蒸馏水溶解并定容至250mL。 (17) Folin 甲参考北京来亨科贸有限责任公司技术文章。 (18) Folin 乙参考北京来亨科贸有限责任公司技术文章。 (三)材料 (1)新鲜牡蛎。 (2)新鲜兔肝。 三、实验程序 (一)操作方法 1.牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 销售中心:北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A (1)称取 100g牡蛎(蒸馏水洗净),加入150预先冷却的 0.01mol/L TrisHCL 缓冲液 (PH7.5,含0.1mol/LNaCl),于高速组织捣碎机匀浆1min,量匀浆体积,于冰箱4℃放置 3h 进行抽取。 (留匀浆液10ml, 采用离心或过滤,得到上清液,待测酶的比活力) (2)缓慢加入20%(V/V)冰冷的正丁醇,边加边搅拌均匀。冰箱放置 2~3h。 (3)室温离心, 4000r/min 30min,收集离心上清液,并量体积。。(留5ml上清液,对含 0.1mol/L NaCl的0.01mol/L TrisHCL 缓冲液 PH7.5透析平衡,待测酶的比活力。)(4)在正丁醇处理的上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35 饱和度(100ml加入20.9g)。缓慢加人,元不断搅拌溶解,置冰箱静置4h。 (5)室温离心, 4 000 r/min 30 min, 收集离心上清液,并量体积。。(留5ml上清液, 对0.01mol/LTrisHCL缓冲液 PH7.5含0.1 mol/L NaCl透析平衡,待测酶的比活力)。 (6) 0.35 mol/L饱和硫酸铵上清液,加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度(100ml加入23.8g)。缓慢加入,不断搅拌溶解,置冰箱静置4h. (7)室温离心,4 000 r/min 30 min,收集沉淀物。 (沉淀蛋白上浮,先把下面清液虹吸出来,余少量清液连同沉淀一起离心) (8)得到沉淀物,溶于20mL 含 0.1mol/LNaCl 的 0.01mol/L risHCL 缓冲液 PH7.5。装入透析袋,先对预冷的 0.5% NaCl透析(常换透析液), 至无SO4被检测出为止(可用一定浓度 BaCl2溶液检验)。再对 0.01 mol/L Tris·HCl pH7.5缓冲液透析平衡。 (9)取出酶溶液,冷冻高速离心(0℃:25 000 r/min 30 min)。(10)离心上清液即为粗酶制剂,检测酶的比活力。装人棕色瓶于4℃冰箱保存。 2.兔肝碱性磷酸酶的分离提取 (1)取2g新鲜免肝剪碎后,置于玻璃匀浆管中,加入0.01 mol/L醋酸镁, 0.01 mol/L醋酸钠 6ml, ( 销售中心:北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 研磨2一3 min。将匀浆倒入刻度离心管中,记录其体积。吸出0.1ml 置于另一试管中,在此试管中加 4.9mlPH8.8 Tris ·HCI缓冲液稀释,待测比活力。 (2)加2ml正丁醇于匀浆中,用玻璃棒充分搅拌2 min 左右,然后在室温中旋转 20min。用滤纸过滤,滤液置于刻度离心管中。 (3)滤液中加入等体积的冷丙酮,立即混匀后离心(2000 r/min)5min, 弃去上清液。在沉淀中加入0.5 mol/L 醋酸镁4mL, 用玻璃充分搅拌使其溶解,记录溶液体积。吸取 0.1ml。置于另一试管中,在此试管中加入 PH8.8 Tris ·HCI缓冲液4.9ml, 待测比活力。 (4)在溶液中缓慢加人冷95%乙醇,使乙醇最终浓度达30%,混匀后离心(2000r/min) 5min, 将上清液倒人另一离心管中,弃去沉淀。上清液中加人冷95%乙醇,使乙醇最终浓度高达60%,混匀后离心(2500 r/min)5 min, 弃去上清液,沉淀中加人0.5 mol/L 醋酸镁3ml,使其充分溶解,并记录体积。吸取0.2mL置于另一试管中,加入pH8.8 TrisHCI缓冲液 3.8ml, 待测比活力。 (5)上述溶液中逐渐滴加人冷丙酮。使丙酮最终浓度达33%。混匀后离心((2000 r/min)5 min, 弃去沉淀,上清液则在另一刻度离心管中再缓慢加入冷丙酮。使丙酮最终浓度达50%。混匀后离心((4000r/min)10 min,, 弃去上清液,沉淀即为部份纯化的碱性磷酸酶。此沉淀中加入 pH8.8 Tris HCI缓冲液 4ml使其溶解,并记录体积,吸取0.5 mL 置于另一试管中,加入 pH8.8 Tris HCI 缓冲液 2mL稀释,待测比活力。 3.比活力测定 (1)对硝基苯酚标准曲线的制作:取15支试管编号,0号一支,1~7号各二支,按表10-1操作: ( 销售中心:北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) ( 技术中心:北京金桥科技产业基地 ) 景盛南二街33号4号楼4层 表10-1 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 pNP含量/umolL- 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.5umol/ml pNP/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 H2O/ml 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Na2CO3-NaHCO3/ml 20 mmol/L MgCl2/ml 0.1 mol/L NaOH/ml 以对硝基苯酚的绝对量 (umol/L) 为横坐标,OD405值为纵坐标,绘制标准曲线。示出 pNP的克分子消光系数(E)值。 (2)酶活力的测定:取干净的试管21支,编号,0号一支作为空白对照,以缓冲液代替酶液;1~4号各3支,作为各步的酶样测定;1'一4'各2支,作为相应的样品对照;各管加入1.98ml底物溶液(试剂9),于37℃恒温水浴中预热5 min, 1一4号管分别加人各步酶样20pl,精确反应 10min,各管加入2 mL 0.1 mol/LNaOH 终止反应并显色,0号加入20p1 Tris . HCI缓冲液代替酶液,1'一4'管先加入NaOH 后再分别补加对应的酶液20ul。以0号管调零点,于722分光光度计测定各管的OD405值,各个测定管的平均 OD值减去对照管的平均OD 值,从对照标准曲线求出产物的umol数,算出酶活力。 (3)蛋白农度的测定:上述分离提取的四步酶制剂按一定比例用 Tris .HCI 缓冲液稀释,稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定,以1步骤所提的碱性磷酸酶为例,,一般第一步和第四步稀释40一50倍,第二步稀释5一10倍。第三步稀释2一5倍。 取干净的试管13支,编号,0号一支作为空白试验,加入 0.5 mLTris . HCI 缓冲液稀释 PH7.5;1~4号管各3支,作为各步的酶样测定,各管加人相应的已稀释的酶液0.5 mL;各管加入Folin-酚试剂甲 4mL,室温放置 10 min, 再加入 Folin-酚试剂乙 0.5 mL, 混匀,放置30 min。以0号管调零点,于722分光 ( 销售中心:北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) ( 技术中心:北京金桥科技产业基地 ) 光度计测定各管的OD650值,从对照标准曲线求出各样品的蛋白浓度。 4.结果处理 计算: C酶活力/U·mL1=-X AtxVD蛋白质浓度/mg·mL=×A×B0.5ml 式中:为透析后的体积变化系数;B为稀释倍数,C为由标准曲线查得的 pNP (mol/L),t为反应时间,D为由标准曲得的蛋白的质量(mg), V1为测定酶活力所用的酶量(ml)。 酶活力/U·mL 酶的比活力/U·mg1= ×A×B 蛋白浓度/mg·mL 北京来亨科学仪器有限公司 销售中心:北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心:北京金桥科技产业基地 景盛南二街33号4号楼4层 技术中心:北京金桥科技产业基地景盛南街楼层 京来亨科学仪器有限公司技术中心:北京金桥科技产业基地景盛南街楼层 一、实验原理碱性磷酸酶(alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase)广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中,ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关,参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域,一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。为了获得好的提取效果,在酶的制备过程,特别应注意以下几点:(1)选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始,否则应在低温下保存。(2)用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时,要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细,需缓慢加入并及时搅拌溶解,尽量防止泡沫形成,以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀,要静置20min以上,以使沉淀完全,然后方可时行离心分离。(3)有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作,缓慢加入,充分搅拌,避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后,最好立即将其溶于适量缓冲液中,以避免酶活力的丧失。(4)在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大,提纯步聚才有效。 酶活力的分析:通常是以对—硝基苯磷酸二纳(pNPP)为底物,在PH10.1的碳酸盐缓冲液(含2mmol/L Mg2+)的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯( pNP)在405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下,以5mmol/L pNPP为底物,在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。
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