小颗粒中的细胞外囊泡 (extracellular vesicle, EV) 和微球检测方案(流式细胞仪)

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应用简报 Agilent细胞分析 Trusted Answers 使用 NovoCyte Advanteon 流式细胞仪进行高灵敏度 SSC 和荧光检测 本应用简报介绍了 Agilent NovoCyte Advanteon流式细胞仪分析小颗粒的性能，包括由细胞形成的细胞外囊泡 (extracellular vesicle， EV) 和微球。 NovoCyte Advanteon流式细胞仪配备了先进的检测器，能够提供高灵敏度的侧向角散射 (side scatter， SSC)和荧光检测，获得比传统流式细胞仪更出色的检测结果。 人们已经认识到由细胞形成的 EV 在多种生物过程中都发挥着重要作用，其也逐渐成为生物医学研究领域的热点。正常细胞和病理状态下的细胞都会释放EV， 它是由细胞形成的膜性囊泡。根据它们的细胞起源和大小可分为外泌体、微囊泡和凋亡小体。外泌体起源于细胞的内吞过程，大小为 50-150 nm。微囊泡的形成方式是细胞表面出芽，大小为50 nm-1 pm，凋亡小体则是细胞发生程序性细胞死亡所释放出的 0.8-5 um 的囊泡。EV 在细胞内通讯中发挥着重要作用，在血液、其他生物体液和细胞培养上清液中都发现了 EV。 EV 与许多疾病密切相关，包括癌症转移、血液疾病、心血管疾病、传染病等。EV 作为一种无细胞疗法来治疗癌症和其他疾病具有潜在的应用前景，且已有广泛的研究。目前主要使用蛋白质印迹和酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 检测 EV，这些技术可以测定纯化颗粒的整体蛋白质浓度，但不能分析单个颗粒的蛋白质表达。利用流式细胞术进行小颗粒研究能够改善现有的检测方法，该技术能够对大量单个颗粒进行分析并检测表面的蛋白质水 平。然而，由于EV直径小、成分多变，传统的流式细胞仪难以对其进行分析。随着流式细胞术的不断发展， 如 NovoCyteAdvanteon 流式细胞仪，其检测能力也不断提升，能够检测EV 等小颗粒。本研究使用微球和细胞来源的EV，考察了NovoCyte Advanteon 流式细胞仪分析小颗粒的能力。 NovoCyte Advanteon 流式细胞仪可以使用灵敏的 SSC 检测小颗粒微球为了确定 NovoCyte Advanteon 流式细胞仪分析小颗粒的能力，我们首先分析了3种商品化的小颗粒微球混合物： 不同大小空白标准微球 (NIST-traceable size standards， Bang'slaboratories) ( ApogeeMix微球 ) BioCytex-Plus FSC 和 SSC 混合微球这些微球大小为100-1300 nm。 NovoCyteAdvanteon 流式细胞仪配备灵敏度更高的SSC 检测器，因此仅使用 SSC 就可以分析小至100nm的微球(图1)。 使用流式细胞术对生物小颗粒进行高灵敏度分析 膜囊泡的折射率 (refractive index， RI) 与微球的折射率不同，因此确定 NovoCyteAdvanteon流式细胞仪检测生物来源的EV 的能力非常重要。我们分析了来自表达绿色荧光蛋白(GFP) 的 HEK293T 细胞的纯化脂质颗粒，这些脂质颗粒通过鼠类白血病病毒(MLV)诱导释放。根据动态光散射测定结果，这些脂质颗粒大小约为240 nm (图2A)。通过 SSC 和 GFP 荧光将脂质颗粒与背景分离(图2B)。此外， NovoCyte Advanteon 流式细胞仪配备有注射泵，能够精确测量样品体积，直接对脂质颗粒进行绝对计数。图2C 显示了连续稀释的 MLV 诱导的脂质颗粒的结果。对于小颗粒检测而言，确保对单个颗粒进行分析非常重要。如果颗粒的浓度过高，颗粒之间靠得太近，检测时多个颗粒可能会被当成一个颗粒。这种现象称为重合(coincidence) 或蜂群效应(swarm effect)。 通常在检测阈值以下的单个颗粒易被检测为累积事件，因为这使它们能够达到触发阈值。这种效应会使数据失真，使得检测到的样品浓度和表型不够准确。一种解决办法是对样品进行连续稀释，以确保进行单颗粒检测。如果没有重合，通过连续稀释应观察到样品浓度呈线性下降。根据实测的绝对事件数量，实际稀释倍数与计算得出的稀释倍数表现出良好的相关性(图2C)，证实了检测到的事件并非是由于重合。这些数据展示了NovoCyte Advanteon 流式细胞仪对膜性小颗粒的检测能力。 图 1. Agilent NovoCyte Advanteon 流式细胞仪检测小颗粒微球。使用3种商品化的小颗粒微球来证明NovoCyte Advanteon 流式细胞仪侧向角散射 (SSC)的高灵敏度：不同大小空白标准微球 (NIST-traceable sizestandards， Bang's laboratories) (A)， ApogeeMix 微球(B)和 BioCytex Megamix-Plus (C)。很容易从背景中分辨出小到 100 nm 的颗粒。仪器设置： SSC-H增益1000， FSC-H增益1000， 阈值 SSC-H 高于 1000 样品1 A 100- 动态光散射 缓冲液B 105.5 80- 60- 40· 20- 0 100 10000 1000000 直径(nm) C 6.0 5.5 D GFP+ 事件/pL 稀释倍数 实测稀释倍数 样品1 219098 样品2 20629 10 10.62 样品3 2015 100 108.75 图 2.使用 Agilent NovoCyte Advanteon 流式细胞仪检测 MLV 诱导的脂质颗粒。(A)利用动态光散射来检测脂质颗粒大小。(B)连续稀释的脂质颗粒的 GFP-H 与 SSC-H关系图。样品1：1：1000，样品2：1：10000，样品3：1：100000。(C，D) GFP+ 事件绝对计数的线性，通过连续稀释的样品的体积计数得到， (C，D)稀释倍数与 GFP+事件浓度的线性曲线。仪器设置： SSC-H增益900，阈值 FITC-H 高于220， 14 pL/min 血小板活化增加血浆中 EV的释放 血小板活化后会释放促凝血的EV，例如在血栓形成或炎症反应过程中。这些颗粒大小为 50 nm-1 pm 不等，然而，大多数血浆来源的 EV 大小为 100-250 nm。为了诱导 EV 的释放，使用 ADP活化血小板。活化之后，使用超速离心法分离所有EV，然后用 anti-CD9、anti-CD61 抗体和膜联蛋白Ⅴ对EV进行染色标记(图3)。 CD61是一种非常常见的血小板表面受体，可识别血小板来源的EV，而膜联蛋白V和 CD9 通常用作EV的通用标志物。使用 ADP 活化血小板后， EV 浓度增加了5倍多(图3H)。通过表达的 CD9测得的EV浓度最高(图3A和图3B)。大多数 CD9+ EV 也表达膜联蛋白Ⅴ和 CD61，证实它们来源于血小板。通过 CD61或膜联蛋白V的表面表达测得的 EV浓度较低，表明血浆中的EV具有异质性。为了 确认检测到的颗粒是膜囊泡，而不是蛋白聚集物或其他非膜性结构，将样品与去垢剂Triton-X孵育1小时，以破坏质膜并消除样品中存在的任何囊泡。经 Triton-X处理后，之前检检到的 EV 消失，仅存在背景事件，表明检测到的事件为 EV。总之，使用NovoCyte Advanteon 流式细胞仪，通过血小板或EV 特异性标志物能够轻松检测到血小板来源的 EV。 图3.通过流式细胞术能够分析血小板活化后增加的EV释放。使用柠檬酸钠采血管采集供体血样。单独使用 200 umol/L ADP 或生理盐水处理全血30分钟。然后离心分离 EV： 2500×g离心15分钟(2次)，然后将上清液在110000×g下离心90分钟(2次)。接着用 aCD9 PE-Cy7、aCD61 APC 抗体和膜联蛋白 V FITC 染色。在生理盐水处理的对照(A、C、E)或 ADP 处理的样品(B、D、F)中，通过CD9 (A、B)和膜联蛋白Ⅴ(C、D)以及 CD61(E、F)鉴定 EV。(G)分析已鉴定出的EV，考察是否共表达其他 EV 标志物(A-F，右图)。取一部分囊泡用 1% Triton-X-100 在冰上孵育1小时。(H)本文所述条件下获得的 EV 浓度图。仪器设置： SSC-H增益1000，阈值SSC-H 高于1000 ( 各种细胞都会释放EV， 在生物体液和细 胞培养上清液中均发现了 EV。它们很容易获得和携带重要的生物信息。它们是癌 症、传染病和病理状态的潜在生物标志物，表明它们在疾病研究中具有重要价 值。 A gilent NovoCyte Advanteon 流式细 胞仪配备了先进的检测器，具有高灵敏度 的 SSC 和荧光检测功能，克服了传统流 式细胞仪进行小颗粒检测的许多挑战。 ) ( 1. S hao， H. et al . New Technologies f orAnalysis of Extracellular Vesicles.Chem. Rev.2018，118(4)，1917-1950 ) ( 2 Aatonen， M. T . et al. Isolation and Characterization of Platelet- D erivedExtracellular Vesicles. J. Extracell. Vesicles 2014， 3 ) ( 3. O steikoetxea，X. et al. D ifferentialDetergent Sensitivity of ExtracellularVesicle Subpopulations.Org. B iomol. Chem. 2015，13(38)，9775-9782 ) ( 4. Becker， A. et al.Extracellular Vesiclesin Cancer： Cell-To-Cell Mediators ofMetastasis. Cancer Cel/ 2016，30(6)， 836 - 848 ) ( 5. X u， R .et al. Extracellular Vesicle Isolation and Characterization ： T oward Cl i nical Application. J. Clin.Invest. 2016， 126(4)， 1152-1162 ) 6. Aatonen， M. T. et al. Isolation andCharacterization of Platelet-DerivedExtracellular Vesicles. J. Extracell. Vesicles 2014， 3 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2019 本应用介绍了 Agilent NovoCyte Advanteon 流式细胞仪分析小颗粒的性能，包括由细胞形成的细胞外囊泡 (extracellular vesicle, EV) 和微球。NovoCyte Advanteon 流式细胞仪配备了先进的检测器，能够提供高灵敏度的侧向角散射 (side scatter, SSC)和荧光检测，获得比传统流式细胞仪更出色的检测结果。