广东湛江牡蛎（生蚝）酶解产物 EPO中蛋白质和脂肪含量的检测

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牡蛎酶解产物改善睡眠作用效果研究大连海洋大学学报ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＤＡＬＩＡＮ ＯＣＥＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＶｏｌ.３６ Ｎｏ.３Ｊｕｎｅ ２ ０ ２ １第 ３６卷第 ３期２ ０ ２ １年 ６月 第３期张婷ꎬ等:牡蛎酶解产物改善睡眠作用效果研究１３４ ＤＯＩ :１０.１６５３５ / ｊ.ｃｎｋｉ.ｄｌｈｙｘｂ.２０２０－１８１ 文章编号 :２０９５－１３８８(２０２１)０３－０４３０－０７ 牡蛎酶解产物改善睡眠作用效果研究 张婷 １ꎬ 秦小明 １ꎬ ２∗ꎬ 章超桦 １ꎬ ２ꎬ 曹文红 １ꎬ ２ꎬ 郑惠娜 １ꎬ ２ꎬ 高加龙 １ꎬ ２ꎬ 林海生 １ꎬ ２ (１??广东海洋大学食品科技学院 ꎬ 广东湛江 ５２４０８８ꎻ ２??广东省水产品加工与安全重点实验室 ꎬ 广东普通高等学校水产品深加工 重点实验室 ꎬ 国家贝类加工技术研发分中心 (湛江 )ꎬ 南海生物资源开发与利用协同创新中心 ꎬ 广东湛江 ５２４０８８) 摘要 :为探究香港牡蛎 Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ 酶解产物 (ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｏｙｓｔｅｒｓꎬ ＥＰＯ)改善睡眠的 作用效果 ꎬ 将试验小鼠分为阴性对照组 (灌胃等体积蒸馏水 )、阳性对照组 (灌胃地西泮 ２ ｍｇ/ｋｇ 体质量 )及 ＥＰＯ 低 、中 、高剂量组 (分别灌胃 ２５０、 ５００、 １ ０００ ｍｇ/ｋｇ 体质量 ꎬ 分别记为 ＥＰＯ－Ｌ、 ＥＰＯ－Ｍ、 ＥＰＯ－Ｈ)ꎬ 每天灌胃一次 ꎬ 连续灌胃 ３０ ｄ 后进行直接睡眠试验 、延长戊巴比妥钠睡眠时间试验 、戊巴比妥钠阈 下剂量催眠试验和戊巴比妥钠潜伏期试验 ꎬ 并采用 ＥＬＩＳＡ 试剂盒检测小鼠下丘脑和大脑皮层中 ５－羟色胺 (ｓｅｒｏｔｏｎｉｎꎬ ５－ＨＴ)、 γ－氨基丁酸 (ｇａｍｍａ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄꎬ ＧＡＢＡ)、褪黑素 (ｍｅｌａｔｏｎｉｎꎬ ＭＴ)、去甲肾上 腺素 (ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅꎬ ＮＥ)和多巴胺 (ｄｏｐａｍｉｎｅꎬ ＤＡ)的含量 ꎮ 结果表明 :牡蛎酶解产物 ３个剂量组均无 直接睡眠作用 ꎬ 但与阴性对照组相比 ꎬ 均能显著延长小鼠睡眠时间 (Ｐ <０??０５)ꎬ 缩短睡眠潜伏期 (Ｐ <０??０５)ꎬ 且 ＥＰＯ 中剂量组能显著提高小鼠入睡率 (Ｐ <０??０５)ꎻ 与阴性对照组相比 ꎬ ＥＰＯ 低 、中剂量组均能 显著提高下丘脑 ５－ＨＴ、 ＧＡＢＡ 含量 (Ｐ <０??０５)ꎬ 且显著降低下丘脑 ＤＡ、 ＮＥ 含量 (Ｐ <０??０５)ꎬ 高剂量组能 显著降低下丘脑 ＤＡ 含量 (Ｐ <０??０５)ꎻ ＥＰＯ 低剂量组能显著提高大脑皮层 ＧＡＢＡ 含量 (Ｐ <０??０５)ꎬ 中剂量组 能显著提高大脑皮层 ＧＡＢＡ、 ＭＴ 含量 (Ｐ <０??０５)ꎬ 且显著降低大脑皮层 ＤＡ 含量 (Ｐ <０??０５)ꎬ 高剂量组能 显著提高大脑皮层 ＭＴ 含量 (Ｐ <０??０５)ꎬ 且显著降低大脑皮层 ＤＡ、 ＮＥ 含量 (Ｐ <０??０５)ꎮ 研究表明 ꎬ 牡蛎 酶解产物通过提高脑内抑制性神经递质 ５－ＨＴ、 ＧＡＢＡ、 ＭＴ 含量 ꎬ 降低兴奋性神经递质 ＤＡ、 ＮＥ 含量 ꎬ 缩 短睡眠潜伏期 ꎬ 提高睡眠发生率 ꎬ 延长睡眠时间 ꎬ 起到改善睡眠的作用 ꎬ 且灌胃 ＥＰＯ 中剂量 ５００ ｍｇ/ｋｇ 体 质量时改善睡眠效果最佳 ꎮ 关键词 :牡蛎 ꎻ 酶解产物 ꎻ 改善睡眠 ꎻ 神经递质 中图分类号 : Ｓ ９８６??１ꎻ ＴＳ ２５４??４ 文献标志码 : Ａ 睡眠是人体的主动生理过程 ꎬ 可以恢复精神和 解除疲劳 ꎮ 失眠是指难以入睡 、夜间易醒及睡眠质 量差等睡眠障碍问题 [１]ꎬ 失眠对日间工作与生活 影响较大 ꎬ 失眠会带来身体免疫力下降 、神经功能 紊乱 、记忆力减退等不良影响 [２]ꎮ 目前 ꎬ 治疗失 眠多以服用处方药物为主 ꎬ 然而服用药物常伴随过 量 、依赖性及耐药性等弊端 [３]ꎬ 因此 ꎬ 急需开发 天然功能活性物质用于改善睡眠 ꎮ 牡蛎广泛分布于中国广东 、广西等海域 ꎬ 属于 中国主要经济贝类和四大养殖贝类之一 ꎬ 同时也是 第一批纳入药食同源的食物 ꎬ 富含维生素 、蛋白质 等多种营养物质 [４]ꎮ 酶水解是从蛋白质来源获得 生物活性肽的有效方法 [５]ꎬ 研究表明 ꎬ 牡蛎的酶 解产物具有免疫 [６－７]、抗氧化 [８]、创伤愈合 [９－１０]、抗疲劳 [１１]、改善学习记忆 [１２]、抗血栓 [１３]和抑 菌 [１４]等功能活性 ꎬ 然而关于牡蛎改善睡眠的研究 鲜有报道 ꎮ 牡蛎含有丰富的谷氨酸 [１５]ꎬ 有助于促 进 γ－氨基丁酸的合成 ꎬ 同时 ꎬ 其具有较好的抗氧 化能力 ꎬ 可以清除多余的氧自由基 ꎬ 对脑神经具有 保护作用 [１６]ꎮ 牡蛎还含有丰富的牛磺酸 ꎬ 这是一 种 γ－氨基丁酸受体激动剂 ꎬ 有助于促进睡眠 [１７]ꎮ 此外 ꎬ 牡蛎中有含量丰富的金属元素锌 ꎬ 其可以作 为膳食补充剂从而改善睡眠 [１８]ꎬ 这为开展改善睡 眠研究提供了营养及理论基础 ꎮ 本试验中 ꎬ 采用动 物蛋白酶对香港牡蛎 Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ 进行 酶解 ꎬ 探究了牡蛎酶解产物 (ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ 收稿日期 : ２０２０－０７－１２ 基金项目 :财政部和农业农村部 :国家现代农业产业技术体系资助 (ＣＡＲＳ－４９) 作者简介 :张婷 (１９９５—)ꎬ 女 ꎬ 硕士研究生 ꎮ Ｅ－ｍａｉｌ:ｚｈｔｉｎｇ９５＠ １６３??ｃｏｍ 通信作者 :秦小明 (１９６４—)ꎬ 男 ꎬ 博士 ꎬ 教授 ꎮ Ｅ－ｍａｉｌ:ｘｉａｏｍｉｎｇ０５０２＠ ２１ｃｎ??ｃｏｍ ｏｙｓｔｅｒｓꎬ ＥＰＯ)对小鼠睡眠的影响 ꎬ 并初步探讨了 牡蛎酶解产物对睡眠的调节机制 ꎬ 以期为后续研究 与产品开发提供参考依据 ꎮ １ 材料与方法 １??１ 材料 试验用新鲜香港牡蛎购自广东省湛江市东风市 场 ꎮ 试验动物 : ＳＰＦ 级雄性 ＫＭ 小鼠 ２００只 ꎬ 体质 量为 １８~２２ ｇ (济南鹏悦试验动物繁育有限公司 )ꎬ 试验动物生产许可证号为 ＳＣＸＫ (鲁 ) ２０１９－０００３ꎬ 试验动物使用许可证编号为 ＳＹＸＫ (粤 ) ２０１９－ ０２０４ꎮ 试剂 :动物蛋白酶 (广西南宁庞博生物工程有 限公司 )、戊巴比妥钠 (Ｓｉｇｍａ 公司 )、地西泮 (山 东信谊制药有限公司 )、巴比妥钠 (国药集团 )、小鼠 γ －氨基丁酸 (ＧＡＢＡ) ＥＬＩＳＡ 试剂盒 、小鼠 ５－羟色胺 (５－ＨＴ) ＥＬＩＳＡ 试剂盒 、小鼠褪黑 素 (ＭＴ) ＥＬＩＳＡ 试剂盒 、小鼠多巴胺 (ＤＡ)ＥＬＩＳＡ 试剂盒 、小鼠去甲肾上腺素 (ＮＥ) ＥＬＩＳＡ 试剂盒 (江苏酶免实业有限公司 )ꎮ 仪器和设备 : Ｌｙｎｘ ６０００型高速冷冻离心机 、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ 多功能酶标仪 (Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公 司 )、 ＶＡＰＯＤＥＳＴ４５０全自动凯氏定氮仪 (德国 Ｇｅｒｈａｒｄｔ 公司 )、 ＡＴＹ１２４电子天平 (日本岛津株式 会社 )、 ＰＨＳ－３Ｅ 型 ｐＨ 酸度计 (上海仪电科学仪 器股份有限公司 )、Ｎ－４０００旋转蒸发仪 (埃朗科技 国际贸易 (上海 )有限公司 )ꎮ １??２ 方法 １??２??１ 牡蛎酶解产物 ＥＰＯ 的制备 参照李婉 等 [１９]的方法略做改进 ꎮ 将牡蛎肉与其 ３倍体积的 蒸馏水进行匀浆 ꎬ 调节 ｐＨ 至 ７??０ꎬ 加酶量为 １ ０００ Ｕ/ ｇꎬ 于 ５３ ℃恒温磁力搅拌水浴锅中酶解 ５ ｈꎬ １００ ℃沸水浴灭酶 １０ ｍｉｎꎬ 酶解液冷却至室 温后 ꎬ ４ ℃下以 ８ ０００ ｒ/ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎꎬ 用纱布 过滤去除杂质 ꎬ 取上清液进行浓缩 ꎬ 冷冻干燥 ꎮ １??２??２ ＥＰＯ 基本营养成分组成测定 参照 ＧＢ ５００９??３—２０１６、 ＧＢ ５００９??５—２０１６、 ＧＢ ５００９??４—２０１６、 ＧＢ ５００９??６—２０１６、 ＧＢ/Ｔ ９６９５??３１—２００８分 别测定水分 、粗蛋白质 、灰分 、粗脂肪和总糖含 量 ꎮ １??２??３ ＥＰＯ 氨基酸组成测定 参照 ＧＢ５００９??１２４—２０１６测定氨基酸组成 ꎮ １??２??４ 动物分组及处理 试验小鼠适应性喂养 ７ ｄ 后 ꎬ 随机分组 ꎬ 每组 ４０只 ꎬ 设阴性对照组 (灌胃 等体积蒸馏水 )、阳性对照组 (灌胃地西泮 ２ ｍｇ/ｋｇ 体质量 )及 ＥＰＯ 低 、中 、高剂量组 (分别灌胃 ２５０、 ５００、 １ ０００ ｍｇ/ｋｇ 体质量 ꎬ 分别记为 ＥＰＯ－Ｌ、 ＥＰＯ－Ｍ、 ＥＰＯ－Ｈ)ꎮ 各试验组每天灌胃一次 ꎬ 灌胃量为 ０??１ ｍＬ/１０ ｇ 体质量 ꎬ 连续灌胃 ３０ ｄꎮ １??２??５ 直接睡眠试验 阴性对照组 、 ＥＰＯ 各剂量 组末次灌胃 (第 ３０天 )后 ꎬ 观察 ３０ ｍｉｎ 内各组 １０只小鼠是否进入睡眠状态 ꎮ 小鼠翻正反射消失 (翻正反射消失是指小鼠处于仰卧位超过 １０ ｓ 不能 恢复背卧位 )超过 １ ｍｉｎ 判定小鼠进入睡眠 ꎬ 小鼠 恢复翻正反射判定为小鼠觉醒 ꎮ 统计阴性对照组 、ＥＰＯ 各剂量组小鼠入睡数量 [２０]ꎮ １??２??６ 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验 各组小鼠 末次灌胃 １ ｈ 后 ꎬ 各取 １０只小鼠腹腔注射戊巴比 妥钠 (６０ ｍｇ/ｋｇ 体质量 )ꎬ 注射量为 ０??１ ｍＬ/１０ ｇ 体质量 ꎮ 翻正反射消失到恢复的时间定义为小鼠睡 眠时间 ꎬ 比较阴性对照组 、阳性对照组 、 ＥＰＯ 各 剂量组小鼠睡眠的时间 [２０]ꎮ １??２??７ 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验 各组小鼠 末次灌胃 １ ｈ 后 ꎬ 各取 １０只小鼠腹腔注射戊巴比 妥钠 (３０ ｍｇ/ｋｇ 体质量 )ꎬ 注射量为 ０??１ ｍＬ/１０ ｇ 体质量 ꎮ 观察 ３０ ｍｉｎꎬ 统计各组小鼠入睡数量并计 算睡眠发生率 [２０]ꎬ 即 睡眠发生率 ＝入睡动物数 /每组动物数 ×１００％ꎮ １??２??８ 巴比妥钠潜伏期试验 各组小鼠末次灌胃 １ ｈ 后 ꎬ 各取 １０只小鼠腹腔注射巴比妥钠 (３００ ｍｇ/ｋｇ 体质量 )ꎬ 注射量为 ０??１ ｍＬ/１０ ｇ 体质 量 ꎮ 注射巴比妥钠到翻正反射消失的时间定义为睡 眠潜伏期 ꎬ 比较阴性对照组 、阳性对照组 、 ＥＰＯ 各剂量组小鼠睡眠潜伏期 [２０]ꎮ １??２??９ 神经递质水平测定 １)脑组织匀浆液制备 ꎮ 各组小鼠末次灌胃 １ ｈ 后 ꎬ 各取 ５只小鼠解剖 ꎬ 于冰上快速取其下丘脑 、大脑皮层 ꎬ 称重后分别与匀浆液 ＰＢＳ 按照体积比 为 １ ∶ ９进行匀浆 ꎬ ４ ℃下以 ３ ０００ ｒ/ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎꎬ 取上清液 ꎬ 测定 ５－羟色胺 (５－ＨＴ)、 γ－氨基丁酸 (ＧＡＢＡ)、褪黑素 (ＭＴ)ꎬ 以及多巴胺 (ＤＡ)和去甲肾上腺素 (ＮＥ)的含量 ꎮ ２)指标的测定 ꎮ 根据小鼠 ５－ＨＴ 试剂盒说明 绘制 ５－ＨＴ 含量标准曲线 ꎬ 标准曲线回归方程为 ｙ ＝０??００６ ３ｘ ＋０??０８８ １ (Ｒ ２＝０??９９２ ６)ꎮ 根据小鼠 ＧＡＢＡ 试剂盒说明绘制 ＧＡＢＡ 含量 标准曲线 ꎬ 标准曲线回归方程为 大连海洋大学学报 ｙ ＝０??２４９ ３ｘ ＋０??１０６ ７ (Ｒ ２＝０??９８５ ２)ꎮ 根据小鼠 ＭＴ 试剂盒说明绘制 ＭＴ 含量标准曲 线 ꎬ 标准曲线回归方程为 根据小鼠 ＤＡ 试剂盒说明绘制 ＤＡ 含量标准曲 线 ꎬ 标准曲线回归方程为 根据小鼠 ＮＥ 试剂盒说明绘制 ＮＥ 含量标准曲 线 ꎬ 标准曲线回归方程为 根据各标准曲线 ꎬ 计算所测样品的 ５－ＨＴ、ＧＡＢＡ、 ＭＴ、 ＤＡ 和 ＮＥ 含量 ꎮ １??３ 数据处理 试验结果以平均值 ±标准差 (ｍｅａｎ±Ｓ??Ｄ??)表 示 ꎬ 试验数据采用 ＳＰＳＳ ２０??０软件进行分析 ꎬ 两组 数据采用独立 Ｔ 检验法进行分析 ꎬ 多组数据采用 单因素法 (ＡＮＯＶＡ)进行方差分析 ꎬ 睡眠发生率 采用卡方检验法分析 ꎬ 显著性水平设为 ０??０５ꎮ ２ 结果与分析 ２??１ ＥＰＯ 的基本营养成分 经测定 ꎬ ＥＰＯ 基本营养成分中粗蛋白质含量 最高 ꎬ 为 (５５??８１±０??５３)％ꎬ 其次为总糖含量 ꎬ 为 (３０??８３±０??３５)％ꎬ 粗脂肪含量为 (８??７２±０??２０)％ꎬ 灰分含量为 (４??６５±０??４３)％ꎬ 水分含量为 (４??１７±０??１２)％ꎮ ２??２ ＥＰＯ 的氨基酸组成 从表 １可见 : ＥＰＯ 氨基酸组成种类齐全 ꎬ 必 需氨基酸与氨基酸总和的比值为 ４０??４４％ꎬ 符合 ＦＡＯ/ＷＨＯ 推荐标准中理想蛋白质模式 ꎬ 其中苏氨 酸 、缬氨酸 、蛋氨酸 、异亮氨酸 、亮氨酸 、苯丙氨 酸 、赖氨酸的占比分别为 ８??０６％、 ６??３９％、 ３??２４％、６??４４％、 ９??９７％、 ５??６７％、 ０??６７％ꎻ ＥＰＯ 疏水性氨基 酸与氨基酸总和的比值为 ６０??３７％ꎬ 其中脯氨酸 、甘氨酸 、丙氨酸 、缬氨酸 、蛋氨酸 、异亮氨酸 、亮 氨酸 、苯丙氨酸的占比分别为 １２??４５％、 ７??２０％、９??０１％、 ６??３９％、 ３??２４％、 ６??４４％、 ９??９７％、 ５??６７％ꎮ ２??３ ＥＰＯ 对小鼠直接睡眠的影响 从表 ２可见 ꎬ 末次灌胃 ３０ ｍｉｎ 后 ꎬ 阴性对照 组和 ＥＰＯ 各剂量组小鼠均无直接睡眠现象 ꎬ 即 ＥＰＯ 无直接睡眠作用 ꎮ Ｔａｂ??１ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｏｙｓｔｅｒ (ＥＰＯ ) 氨基酸 ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ 牡蛎酶解产物 / (ｇ?１?００ ｇ－１) ＥＰＯ 比率 /％ｒａｔｉｏ 天冬氨酸Ａｓｐ ０??９６ ４??５８ 苏氨酸 Ｔｈｒ∗ １??６９ ８??０６ 丝氨酸 Ｓｅｒ ０??８２ ３??９１ 脯氨酸 Ｐｒｏ＃ ２??６１ １２??４５ 谷氨酸Ｇｌｕ １??１７ ５??５８ 甘氨酸Ｇｌｙ＃ １??５１ ７??２０ 丙氨酸Ａｌａ＃ １??８９ ９??０１ 缬氨酸Ｖａｌ∗＃ １??３４ ６??３９ 蛋氨酸Ｍｅｔ∗＃ ０??６８ ３??２４ 异亮氨酸 Ｉｌｅ∗＃ １??３５ ６??４４ 亮氨酸 Ｌｅｕ∗＃ ２??０９ ９??９７ 酪氨酸 Ｔｙｒ １??２７ ６??０６ 苯丙氨酸 Ｐｈｅ∗＃ １??１９ ５??６７ 赖氨酸 Ｌｙｓ∗ ０??１４ ０??６７ 组氨酸Ｈｉｓ ０??５０ ２??３８ 精氨酸Ａｒｇ １??７６ ８??３９ 氨基酸总和 ｔｏｔａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ２０??９７ — 必需氨基酸总和 ８??４８ ｔｏｔａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ４０??４４ 疏水性氨基酸总和 １２??６６ ６０??３７ ｔｏｔａｌ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ 注 : ∗为必需氨基酸 ꎻ＃为疏水性氨基酸 ꎮ 由于酸的水解和分解 ꎬ 该方法无法测定色氨酸 ꎮ Ｎｏｔｅ: ∗ꎬ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄꎻ ＃ ꎬｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ. Ｔｒｙｐｔｏ￣ｐｈａｎ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｄｕｅ ｔｏ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ. 表 ２ ＥＰＯ 对小鼠直接睡眠的影响 Ｔａｂ??２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｄｉｒｅｃｔ ｓｌｅｅｐ ｉｎ ｍｉｃｅ 组别 ｇｒｏｕｐ 剂量 /(ｍｇ?ｋ?ｇ－１) ｄｏｓｅ 试验动物 / ｉｎｄ??ｔｅｓｔ ａｎｉｍａｌ 睡眠动物 / ｉｎｄ??ｓｌｅｅｐｉｎｇａｎｉｍａｌ 阴性对照组 ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ０ １０ ０ 低剂量组ＥＰＯ－Ｌ ２５０ １０ ０ 中剂量组ＥＰＯ－Ｍ ５００ １０ ０ 高剂量组ＥＰＯ－Ｈ １ ０００ １０ ０ ２??４ ＥＰＯ 对戊巴比妥钠诱导睡眠时间的影响 从表 ３可见 :阳性对照组 、 ＥＰＯ 各剂量组较 阴性对照组均显著延长了戊巴比妥钠诱导小鼠的睡 眠时间 (Ｐ <０??０５)ꎻ 与阴性对照组相比 ꎬ 阳性对照 组对戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间延长了 ８９??８２％ꎬ 低 、中 、高剂量的 ＥＰＯ 对戊巴比妥钠诱 导小鼠睡眠时间分别延长了 ４４??７８％、 ７４??５２％、４５??９６％ꎬ 其中 ＥＰＯ 中剂量组相较于其他剂量组 ꎬ 可以较好地延长小鼠睡眠时间 ꎮ 这说明 ꎬ 在一定剂 量范围内 ꎬ ＥＰＯ 与戊巴比妥钠具有协同作用 ꎬ 可 以延长小鼠睡眠时间 ꎮ ２??５ ＥＰＯ 对戊巴比妥钠阈下剂量睡眠发生率的 影响 从表 ４可见 ꎬ 与阴性对照组相比 ꎬ 阳性对照 组 、 ＥＰＯ 各剂量组的睡眠发生率均有升高 ꎬ 分别 为 ８０％、 ４０％、 ７０％、 ５０％ꎬ 其中仅阳性对照组 、ＥＰＯ 中剂量组与阴性对照组有显著性差异 (Ｐ <０??０５)ꎮ Ｔａｂ??３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｓｌｅｅｐ ｔｉｍｅ ｏｆ ｍｉｃｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ 组别 ｇｒｏｕｐ 试验动物 / ｉｎｄ?? ｔｅｓｔ ａｎｉｍａｌ 睡眠时间 /ｍｉｎ ｓｌｅｅｐ ｔｉｍｅ 阴性对照组 １０ ４１??６７±１３??１９ｃ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ 阳性对照组 １０ ７９??１０±１０??８４ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ 低剂量组ＥＰＯ－Ｌ １０ ６０??３３±１３??４７ｂ 中剂量组ＥＰＯ－Ｍ １０ ７１??８９±２４??１８ａｂ 高剂量组ＥＰＯ－Ｈ １０ ６０??８２±１３??１７ｂ 注 :同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异 (Ｐ <０??０５)ꎬ 标有相同字母者表示组间无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎬ 下同 ꎮ Ｎｏｔｅ:Ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ａｒｅ ｓｉｇ￣ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｔ ｔｈｅ ０??０５ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｌｅｖｅｌꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｔｔｅｒ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ａｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓꎬ ｅｔ ｓｅｑｕｅｎｔｉａ. 表 ４ ＥＰＯ 对戊巴比妥钠阈下剂量睡眠发生率的影响 Ｔａｂ??４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｕｂｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｄｏｓｅ ｏｆ ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ 组别 ｇｒｏｕｐ 试验动物 ｔｅｓｔ ａｎｉｍａｌ/ ｉｎｄ?? 睡眠动物 ｓｌｅｅｐｉｎｇ ａｎｉｍａｌ/ ｉｎｄ?? 睡眠发生率 ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｓｌｅｅｐ /％ 阴性对照组 ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ １０ ２ ２０ａ 阳性对照组 ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ １０ ８ ８０ｂ 低剂量组ＥＰＯ－Ｌ １０ ４ ４０ａ 中剂量组ＥＰＯ－Ｍ １０ ７ ７０ｂ 高剂量组ＥＰＯ－Ｈ １０ ５ ５０ａ ２??６ ＥＰＯ 对巴比妥钠诱导睡眠潜伏期的影响 从表 ５可见 ꎬ 与阴性对照组相比 ꎬ 阳性对照 组 、 ＥＰＯ 各剂量组均显著缩短了小鼠睡眠潜伏期 (Ｐ <０??０５)ꎬ 其中 ꎬ ＥＰＯ 中剂量组可将睡眠潜伏期 缩至最短 ꎮ 这说明 ꎬ ＥＰＯ 与巴比妥钠通过协同作 用 ꎬ 可以显著缩短小鼠睡眠潜伏期 ꎮ 表 ５ ＥＰＯ 对巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响 Ｔａｂ??５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｓｌｅｅｐ ｌａｔｅｎｃｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂａｒｂｉｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ 组别 ｇｒｏｕｐ 试验动物 / ｉｎｄ?? ｔｅｓｔ ａｎｉｍａｌ 睡眠潜伏期 /ｍｉｎ ｓｌｅｅｐ ｌａｔｅｎｃｙ 阴性对照组 １０ ６１??３６±１５??５１ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ 阳性对照组 １０ ３７??０７±５??２３ｂ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ 低剂量组ＥＰＯ－Ｌ １０ ４４??９５±５??２３ｂ 中剂量组ＥＰＯ－Ｍ １０ ４３??４３±１０??４２ｂ 高剂量组ＥＰＯ－Ｈ １０ ４４??２６±４??４６ｂ ２??７ 小鼠下丘脑 、大脑皮层的神经递质水平含量 小鼠下丘脑神经递质水平含量如表 ６所示 ꎬ 其 中 ５－ＨＴ、 ＧＡＢＡ 与 ＭＴ 为抑制性神经递质 ꎬ 与阴 性对照组相比 ꎬ 阳性对照组及 ＥＰＯ 低 、中剂量组 下丘脑的 ５－ＨＴ 和 ＧＡＢＡ 含量均显著升高 (Ｐ <０??０５)ꎬ ＥＰＯ 高剂量组 ５－ＨＴ 和 ＧＡＢＡ 含量略有升 高 ꎬ 但无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎬ 阳性对照组 、ＥＰＯ 低 、中剂量组 ＭＴ 含量有升高 (Ｐ >０??０５)ꎻ ＤＡ 与 ＮＥ 为兴奋性神经递质 ꎬ 与阴性对照组相比 ꎬ 阳性对照组 、 ＥＰＯ 各剂量组 ＤＡ 含量均有显著降低 (Ｐ <０??０５)ꎬ ＥＰＯ 低 、中剂量组 ＮＥ 含量显著降低 (Ｐ <０??０５)ꎬ 阳性对照组 、 ＥＰＯ 高剂量组 ＮＥ 含量 也有所降低 ꎬ 但无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎮ 小鼠大脑皮层神经递质水平含量由表 ７所示 ꎬ 与阴性对照组相比 ꎬ 阳性对照组大脑皮层 ５－ＨＴ 含 量显著升高 (Ｐ <０??０５)ꎬ ＥＰＯ 低 、中剂量组 ５－ＨＴ 含量略有升高 ꎬ 但无显著性差异 (Ｐ >０??０５)ꎻ 阳性 对照组及 ＥＰＯ 低 、中剂量组 ＧＡＢＡ 含量均显著升 高 (Ｐ <０??０５)ꎬ ＥＰＯ 高剂量组 ＧＡＢＡ 含量略有升 高 (Ｐ >０??０５)ꎻ 阳性对照组 、 ＥＰＯ 各剂量组 ＭＴ 含 量均高于阴性对照组 ꎬ 其中阳性对照组及 ＥＰＯ 中 、高剂量组 ＭＴ 含量有显著性提高 (Ｐ <０??０５)ꎻ 阳性 对照组及 ＥＰＯ 中 、高剂量组 ＤＡ 含量均显著降低 (Ｐ <０??０５)ꎬ ＥＰＯ 低剂量组 ＤＡ 含量略有降低 (Ｐ > ０??０５)ꎬ 阳性对照组及 ＥＰＯ 低 、中剂量组 ＮＥ 含量 ０??０５)ꎻ ＥＰＯ 高剂量组 ＮＥ 含量显著降低 (Ｐ < 略有降低 (Ｐ >０??０５)ꎮ 表 ６ ＥＰＯ 对小鼠下丘脑神经递质水平的影响 ( ｎ ＝５) Ｔａｂ??６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ (ｎ ＝５) 组别 ｇｒｏｕｐ ５－ＨＴ/ (ｎｇnｍＬ－１) ＧＡＢＡ/ (μｍｏｌlｍＬ－１) ＭＴ/ (ｎｇnｍＬ－１) ＤＡ/ (ｐｇLｍＬ－１) ＮＥ/ (ｎｇLｍＬ－１) 阴性对照组 ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ １１５??９３±１９??３２ｃ ３??２３±０??３５ｃ ７３??４５±６??８７ａｂ １２６??５５±３??０２ａ ５??２０±０??６５ａ 阳性对照组 ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ １６８??８１±３０??４５ａ ４??２１±０??１８ａｂ ７９??２０±７??９８ａ １０８??９１±５??１９ｂ ４??７１±０??３６ａｂ 低剂量组ＥＰＯ－Ｌ １６１??５６±１８??５５ａｂ ４??５２±０??３９ａ ７４??５５±３??１１ａｂ １１４??５４±９??８９ｂ ４??５０±０??３６ｂ 中剂量组ＥＰＯ－Ｍ １６７??５１±３１??２９ａ ４??０８±０??６４ａｂ ７７??６５±４??７６ａ １１１??２６±６??８１ｂ ４??３７±０??２１ｂ 高剂量组ＥＰＯ－Ｈ １３５??９０±１５??３３ｂｃ ３??６９±０??２１ｂｃ ６７??５０±５??４３ｂ １１３??０３±１２??９５ｂ ４??７７±０??２６ａｂ 表 ７ ＥＰＯ 对小鼠大脑皮层神经递质水平的影响 ( ｎ ＝５) Ｔａｂ??７ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＰＯ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｏｆ ｍｉｃｅ (ｎ ＝５) 组别 ｇｒｏｕｐ ５－ＨＴ/ (ｎｇnｍＬ－１) ＧＡＢＡ/ (μｍｏｌlｍＬ－１) ＭＴ/ (ｎｇnｍＬ－１) ＤＡ/ (ｐｇLｍＬ－１) ＮＥ/ (ｎｇnｍＬ－１) 阴性对照组 ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ １３３??１６±１３??１０ｂ ３??０４±０??３９ｂ ６７??９０±７??４７ｂ １２７??１５±４??１１ａ ４??６８±０??２７ａ 阳性对照组 ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ １５３??３２±１５??８６ａ ４??０７±０??５２ａ ８１??１０±４??５４ａ １１６??００±３??７８ｂｃ ４??２７±０??３０ａｂ 低剂量组ＥＰＯ－Ｌ １３４??３０±１４??３９ｂ ３??７４±０??５４ａ ７４??５５±４??８８ａｂ １２４??２０±４??１６ａｂ ４??４６±０??０９ａｂ 中剂量组ＥＰＯ－Ｍ １４１??１９±２０??３６ａｂ ３??８２±０??４４ａ ７９??２０±７??０９ａ １０６??８９±１２??７９ｃ ４??２９±０??４２ａｂ 高剂量组ＥＰＯ－Ｈ １３０??８７±４??８６ｂ ３??４６±０??５４ａｂ ７６??３５±２??７０ａ １１１??５１±７??１９ｃ ４??１５±０??２３ｂ ３ 讨论 ３??１ ＥＰＯ 营养成分对改善睡眠作用影响 本研究结果显示 ꎬ ＥＰＯ 蛋白质含量丰富 ꎬ 脂 肪含量低 ꎬ 其中谷氨酸含量为 １??１７ ｇ /１００ ｇꎬ 占氨 基酸总和的 ５??５８％ꎬ 甘氨酸含量为 １??５１ ｇ /１００ ｇꎬ 占氨基酸总和的 ７??２０％ꎮ 同时 ꎬ 基于课题组前期 研究 ꎬ 相同制备方法下得到的牡蛎酶解产物微量元 素中锌含量最高 ꎬ 为 ４４０??６７ ｍｇ /ｋｇꎬ 牛磺酸含量 为 ３４??２１ ｍｇ / ｇ[１６]ꎮ 研究表明 ꎬ 甘氨酸可以通过血 脑屏障进入大脑 ꎬ 通过作用于视交叉上核 (ＳＣＮ)中的 ＮＭＤＡ 受体 ꎬ 从而调节睡眠 [２１]ꎻ 谷氨酸与牛 磺酸可以促进抑制性神经递质 ＧＡＢＡ 的产生 ꎬ 锌 作为膳食补充剂可以起到改善睡眠质量的作用 [１８]ꎮ 因此 ꎬ ＥＰＯ 营养成分中相关氨基酸与微量元素能 为改善睡眠提供营养支持 ꎮ ３??２ ＥＰＯ 对小鼠行为学的影响 本研究中参照 «保健食品检验与评价技术规 范 »[２０]进行了 ＥＰＯ 对小鼠睡眠影响试验研究 ꎮ 直 接睡眠试验是为了探究 ＥＰＯ 是否有直接睡眠效果 ꎻ 戊巴比妥钠是一种作用于大脑中枢神经的药物 ꎬ 通 过肝酶代谢 ꎬ 腹腔注射戊巴比妥钠后 ꎬ 若试验组睡 眠时间延长并与阴性对照有显著性差异 ꎬ 即试验结 果为阳性 ꎬ 说明 ＥＰＯ 与戊巴比妥钠协同改善睡眠 ꎻ 为排除 ＥＰＯ 对肝酶有抑制效果 ꎬ 造成假阳性的结 果 ꎬ 进行戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验 ꎬ 若试验组 睡眠发生率与阴性对照有显著性差异 ꎬ 即试验结果 为阳性 ꎻ 巴比妥钠也是对中枢系统有抑制作用的药 物 ꎬ 腹腔注射巴比妥钠后 ꎬ 若试验组睡眠潜伏期有 显著缩短 ꎬ 说明 ＥＰＯ 与巴比妥钠也有协同作用 ꎬ 试验结果为阳性 ꎮ 本研究中 ꎬ 延长戊巴比妥钠睡眠 时间试验 、戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验和巴比妥 钠睡眠潜伏期试验显示 ꎬ ２项试验结果均为阳性 ꎬ 说明 ＥＰＯ 具有改善睡眠的作用 ꎮ 该结果与 Ｓａｉｔｏ 等 [２２]的研究结果一致 ꎮ ３??３ ＥＰＯ 对小鼠下丘脑 、大脑皮层神经递质水平 的影响 睡眠是一种昼夜活动 ꎬ 发生于大脑中 ꎬ 下丘 脑 、大脑皮层和海马等神经组织结构与睡眠有着密 切的联系 [２３]ꎮ 下丘脑位于丘脑下方 ꎬ 是高级神经 中枢 ꎬ 下丘脑中包含大量神经元 ꎬ 主要为 ＧＡＢＡ 能神经元 、下丘脑腹外侧视前核 (ＶＬＰＯ)神经元 和黑色素浓缩激素 (ＭＣＨ)神经元 ꎬ 这些神经元 在促进睡眠中发挥着重要的作用 [２４]ꎮ 大脑皮层中 存在着大量的神经元细胞参与睡眠 /觉醒调节 ꎬ 此 外 ꎬ 大脑皮层神经细胞的波动可以产生慢波睡眠 ꎬ 有助于提高睡眠质量 [２５]ꎮ 神经递质分为兴奋性神 经递质和抑制性神经递质 [２６]ꎮ ５－羟色胺 (５－ＨＴ)ꎬ 又名血清素 ꎬ 是一种抑制性神经递质 ꎬ 研究表明 ꎬ ５－ＨＴ 含量下降会导致不同程度的失眠 [２７]ꎮ γ－氨 基丁酸 (ＧＡＢＡ)是神经中枢的主要抑制性神经递 质 ꎬ 由谷氨酸经过脱羧合成而来 ꎬ ＧＡＢＡ 含量升高 有利于睡眠时间的延长 ꎬ 催眠药物都是基于 ＧＡＢＡＡ 受体进行调控睡眠 [２８]ꎮ 褪黑素 (ＭＴ)是一 种由色氨酸合成的抑制性神经递质 ꎬ 褪黑素可以缩 短入睡潜伏期 、延长睡眠持续时间及提高睡眠质 量 [２９]ꎮ 多巴胺 (ＭＴ)是去甲肾上腺素的前体 ꎬ 是 与睡眠有关的兴奋性神经递质 ꎬ 多巴胺可以调节情 绪 ꎬ 并促进觉醒 [３０]ꎮ 去甲肾上腺素 (ＮＥ)也是促 进觉醒的兴奋性神经递质 ꎬ 失眠状态下 ꎬ ＮＥ 含量 升高 [３１]ꎮ 本研究中 ꎬ 与阴性对照组相比 ꎬ ＥＰＯ 各 剂量组中 ５－ＨＴ、 ＧＡＢＡ 和 ＭＴ 含量的升高 ꎬ 可能 与牡蛎中含有的谷氨酸 、牛磺酸有关 [１６－１７]ꎬ 而 ＥＰＯ 各剂量组中 ＤＡ 和 ＮＥ 含量的降低 ꎬ 可能与牡 蛎中锌含量丰富有关 [１８]ꎮ ４ 结论 １) ＥＰＯ 可以提供改善睡眠相关的甘氨酸 、谷 氨酸等氨基酸及微量元素 ꎬ 并与戊巴比妥钠协同延 长小鼠睡眠时间 ꎬ 提高睡眠发生率 ꎬ 与巴比妥钠协 同缩短小鼠睡眠潜伏期 ꎬ 具有改善睡眠的作用 ꎮ ２) ＥＰＯ 通过提高脑内 ５－ＨＴ、 ＧＡＢＡ、 ＭＴ 抑 制性神经递质含量 ꎬ 降低 ＤＡ、 ＮＥ 兴奋性神经递 质含量 ꎬ 起到改善睡眠的作用 ꎮ ３) ＥＰＯ ３个剂量均有改善睡眠的作用 ꎬ 其中 用 ＥＰＯ５００ ｍｇ/ｋｇ 体质量灌胃小鼠 ꎬ 改善睡眠效果 最佳 ꎮ 参考文献 : [１] ＹＵＣＱꎬＳＨＩ Ｚ ＭꎬＬＶ Ｊꎬｅｔ ａｌ.Ｄｉｅｔａｒｙ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｉｎｓｏｍｎｉａ ｓｙｍｐ￣ｔｏｍｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｄｕｌｔｓ:ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ ｋａｄｏｏｒｉｅ ｂｉｏｂａｎｋ[Ｊ].Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓꎬ ２０１７ꎬ９(３):２３２. 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[３０] ＲＡＤＷＡＮＢꎬＬＩＵ ＨꎬＣＨＡＵＤＨＵＲＹ Ｄ.Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｉｎ ｍｏｏｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｒｈｙｔｈｍｓ ａｎｄ ｓｌｅｅｐ－ｗａｋｅ ｃｙｃｌｅ[Ｊ].Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１９ꎬ１７１３:４２－５１. [３１] ＭＩＴＣＨＥＬＬ Ｈ ＡꎬＷＥＩＮＳＨＥＮＫＥＲＤ.Ｇｏｏｄ ｎｉｇｈｔ ａｎｄ ｇｏｏｄ ｌｕｃｋ:ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ ｉｎ ｓｌｅｅｐ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ[ Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａ￣ｃｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ７９(６):８０１－８０９. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｏｙｓｔｅｒ ｏｎ ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＺＨＡＮＧ Ｔｉｎｇ１ꎬ ＱＩＮ Ｘｉａｏｍｉｎｇ１ꎬ２∗ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｃｈａｏｈｕａ１ꎬ２ꎬ ＣＡＯ Ｗｅｎｈｏｎｇ１ꎬ２ꎬ ＺＨＥＮＧ Ｈｕｉｎａ１ꎬ２ꎬ ＧＡＯ Ｊｉａｌｏｎｇ１ꎬ２ꎬ ＬＩＮ Ｈａｉｓｈｅｎｇ１ꎬ２ (１. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４０８８ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｑｕａｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙꎬ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ａｑｕａｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎꎬ Ｎａ￣ｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｒａｎｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ (Ｚｈａｎｊｉａｎｇ)ꎬ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｓｅａ Ｂｉｏ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｌ￣ｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４０８８ꎬ Ｃｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ : Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｏｙｓｔｅｒｓ (ＥＰＯ) ｏｎ ｓｌｅｅｐ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇꎬ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ (ｅｑｕａｌ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ｂｙ ｇａｖａｇｅ)ꎬ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ (ｄｉａｚｅｐａｍ ２ ｍｇ /ｋｇ ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｂｙ ｇａｖａｇｅ) ａｎｄ ｌｏｗꎬ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ＥＰＯ ｇｒｏｕｐｓ (ｇａｖａｇｅ ＥＰＯ ２５０ꎬ ５００ａｎｄ １ ０００ ｍｇ/ｋｇ ｂｏｄｙ ｍａｓｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ｄｅｎｏｔｅｄ ａｓ ＥＰＯ－Ｌꎬ ＥＰＯ－Ｍ ａｎｄ ＥＰＯ－Ｈ). Ａｆｔｅｒｇａｖａｇｅｏｎｃｅ ａ ｄａｙ ｆｏｒ ３０ ｄａｙｓꎬ ｄｉｒｅｃｔ ｓｌｅｅｐ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔꎬ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ ｓｌｅｅｐ ｔｉｍｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔꎬ ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌｓｏｄｉｕｍ ｓｕｂｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｄｏｓｅ ｈｙｐｎｏｓｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ｂａｒｂｉｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄꎬ ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ｗｅｒｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ (５－ＨＴ)ꎬ ｇａｍｍａ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ (ＧＡＢＡ)ꎬ ｍｅｌａｔｏｎｉｎ (ＭＴ)ꎬ ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ (ＮＥ) ａｎｄ ｄｏｐａｍｉｎｅ (ＤＡ) ｉｎ ｍｉｃｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｌｅｅｐ ｔｉｍｅ (Ｐ <０??０５)ꎬ ａｎｄ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｌｅｅｐ ｌａｔｅｎｃｙ (Ｐ <０??０５) ｗｅｒｅ ｏｂ￣ｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ＥＰＯ ｇｒｏｕｐｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐꎬ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｉｒｅｃｔ ｓｌｅｅｐ ｅｆｆｅｃｔ. Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｄｏｓｅ ｏｆ ＥＰＯ ｇｒｏｕｐ ｃｏｍ￣ｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ (Ｐ <０??０５). Ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｏｗ ａｎｄ ｍｅｄｉｕｍ ｄｏｓｅ ｏｆ ＥＰＯ ｇｒｏｕｐｓ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ５－ＨＴ ａｎｄ ＧＡＢＡ (Ｐ <０??０５)ꎬ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ＤＡ ａｎｄ ＮＥ (Ｐ <０??０５)ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｄｉｄꎬ ｗｉｔｈ ｓｉｇ￣ｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ＤＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ (Ｐ <０.０５). Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ＧＡＢＡ ｉｎ ｃｅｒｅ￣ｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ＥＰＯ ｇｒｏｕｐ (Ｐ <０??０５)ꎬ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ＧＡＢＡ ａｎｄ ＭＴ ｉｎ ｃｅｒｅ￣ｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＤＡ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｍｅ￣ｄｉｕｍ ｄｏｓｅ ＥＰＯ ｇｒｏｕｐ (Ｐ <０??０５). Ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ＭＴ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘꎬ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｅ￣ｃｒｅａｓｅｉｎ ＤＡ ａｎｄ ＮＥ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ (Ｐ <０??０５) ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ. Ｔｈｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎｄｉｃａ￣ｔｅｄ ｔｈａｔ ＥＰＯ ｌｅｄ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｌｅｅｐ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ５－ＨＴꎬ ＧＡＢＡ ａｎｄ ＭＴ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎꎬ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ＤＡ ａｎｄ ＮＥꎬ ｂｙ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｌｅｅｐ ｌａｔｅｎｃｙ ｐｅｒｉｏｄꎬ ａｎｄ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｓｌｅｅｐ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ ｓｌｅｅｐ ｔｉｍｅ. Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ : Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ ꎻ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔꎻ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｌｅｅｐꎻ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ