老鱼
第1楼2008/01/17
四.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决?
关于漂移问题:
1温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定
2流动相发生变化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
3柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡
关于快速变化问题
1流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定
2泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出。
3流动相不合适,解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
五.C18柱出什么问题了?买了一根 Kromasil 100-5C18柱,刚开始用时效果较好,条件为30mM KH 2 PO 4 ,pH=2.00,柱温30度。连续使用大约两天后,各标准品峰明显前移。有些原来能分开的峰,现在用同样的条件已经分不开了。最近我继续使用该柱,不同的是每天连续使用时间不超过12小时。使用后先用5%甲醇/水冲洗,再用100%甲醇冲洗。这样使用了三天,峰的保留时间不再前移。因此,我有二个问题: A 峰的前移是由于C18被水解的缘故吗?如不是,又是什么原因呢? B 对于使用低pH纯水系缓冲盐的C18柱,每天使用12小时,用5%甲醇/水洗净缓冲盐,再用甲醇冲洗,能延长C18柱的使用寿命吗?
使用Kromasil 100-5C18出现这种情况是不了解这种柱子的特性。关于上面的二个问题,作如下分析:
1.峰前移的原因是使用了纯水流动相的缘故。kromasil填料以高碳覆盖量而自豪,在纯水(或水比例大于95%)的环境下因为C18官能团非极性排斥,会使伸展状态的官能团在排斥力的作用下“倒伏”,同时也因极性力形成的张力使“水膜”在填料微孔口形成而覆盖微孔口,这两点都使分析物难以与C18官能团接触,保留时间因此提前。极端情况下,甚至丧失保留性质。不仅是C18,对于Kromasil的其他填料,都反对用纯水(或水比例大于95%)的流动相。
2.其后提到“最近我继续使用该柱,不同的是每天连续使用时间不超过12小时。使用后先用5%甲醇/水冲洗,再用100%甲醇冲洗。这样使用了三天,峰的保留时间不再前移。”,这正是采用了正确的方法。用甲醇或乙腈等纯溶剂冲洗较长时间,可以使“倒伏”的官能团回复其原有状态,之前用5%甲醇水溶液洗去盐再用纯甲醇是非常地道的做法!
3.一般不提倡你所提到的纯水使用环境。非要这样用,我也建议你用预柱,缩短这样的使用 时间,及时冲洗,隔夜封存于纯有机溶剂都是很好的柱维护措施。
另外可考虑是否可在流动相中添加 5%的甲醇或乙腈,如不影响分离情况和峰形的话。 其它类型的C18也有这种现象,只是没有Kromasil柱明显,为了克服纯水溶剂长时间运行产生“水性坍塌”对色谱柱分离造成的影响,现在有新型的色谱柱可以在100%水相中稳定。
老鱼
第2楼2008/01/17
六.走空白梯度,在 11-13min出现未知的异常峰,并且峰值还挺大,有机相从0%-100%,这是为什么?
一般走空白梯度是不进样的,大多数情况这些异常峰是流动相本身造成的。在等度洗脱的情况下,流动相的少量杂质一般不会影响基线和噪音,这些杂质要么不出来,要么不间断出来,不会产生异常峰(鬼峰)。对于梯度洗脱,水相或有机相中的强保留杂质在开始洗脱时,由于有机相的比例低,在柱子上保留而不洗脱,但当流动相中有机相比例不断加大,在色谱柱中吸附浓缩的杂质开始被洗脱,从而在某些位置出现异常峰(鬼峰)。还有,如果梯度设置不当,流动相比例变化太快,紫外波长较低时也容易出现异常峰。另外需要注意的是,如果梯度泵的比例阀有问题或流动相混合器效果不好或有少量的气泡存在,也会出现这种现象。因此,对于梯度洗脱,大多数原因在流动相,所以流动相的纯度非常关键,尤其是水的纯度以及添加的流动相改性剂的纯度。
七.我最近更换了另一种牌号的ODS柱,虽然分离情况仍可以,但保留时间不能重现,为什么?
这是因为被分析物可能具有形成氢健的能力。尽管过去几年来,填料的制造技术有了极大的提高,但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此,同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物,如三乙基胺(TEA),将会使硅醇基的成键能力饱和,从而保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。