【分享】GB/T 4789.4-2008-沙门氏菌检验

沙门氏菌检验程序图（GB/T 4789.4-2008）

沙门氏菌检验步骤（GB/T 4789.4-2008）

操作步骤
5.1 前增菌
称取25g( mL）样品放人盛有225 mL BPW的无菌均质杯中，以8 000r/ min一10 000 r/ min均质1min一2 min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min一2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需要，测定pH值，用1mol/mL无菌氢氧化钠或盐酸调pH至6.8士0.2。无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃ 士1℃ 培养8h- 18h。
如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃-5 ℃ 不超过18h解冻。
5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mLTTB内，于42℃ 士1℃ 培养18h一24h。同时，另取1 mL，转种于10 mLSC内，于36℃ 士1℃ 培养18h一24h。
5.3 分离
分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或科玛嘉显色培养基平板）。于36℃ 士1℃ 分别培养18h-24h ( XLD琼脂平板、HE琼脂平板、科玛嘉显色培养基平板）或40h一48h ( BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。
5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取两个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃ 士1℃ 培养18h-24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。
表2说明，在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也均有不是沙门氏菌属的可能。
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种于36℃ 士1℃ 培养18h-24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃-5 ℃ 或室温至少保留24h，以备必要时复查。
5.4.2.1 反应序号 A1典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌属。如有2项异常，为非沙门氏菌属。
5.4.2.2 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3 反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。
5.4.3 如选择API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统，可根据5.4.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1 抗原的准备
一般采用1.2％一1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2%-3%）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％-0.65％半固体琼脂平板的中央，侯菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％-0.4％半固体琼脂的小玻管1次-2 次，自远端取菌培养后再检查
5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定
在玻片上划出两个约1cm*2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加人1滴生理盐水，作为对照再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应
5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定
同5 . 5 . 2
5.5.4 血清学分型（选做项目）
5.5.4.1 O抗原的鉴定
用A-F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。
被A-F多价O血清凝集者，依次用O4；O3；O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验根据试验结果，判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定El、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
不被A-F多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：
O多价1 A , B , C , D , E , F群（并包括6，14群）
O多价2 13 , 16 , 17 , 18 , 21群
O多价3 28 , 30 , 35 , 38 , 39群
O多价4 40 , 41 , 42 , 43群
O多价5 44 , 45 , 47 , 48群
O多价6 50 , 51 , 52 , 53群
O多价7 55 , 56 , 57 , 58群
O多价8 59 , 60 , 61 , 62群
O多价9 63 , 65 , 66 , 67群
5.5.4.2 H抗原的鉴定
属于A-F各O群的常见菌型，依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。
不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以第1相和第2项的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下：
H多价l a，b，c，d，i
H多价2 eh，enx，enz15，fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
H多价3 k , r , y , z ,z10，Iv ,Iw ,Iz13 ,Iz28,Iz40
H多价4 1，2； 1，5；1，6；1，7；Z6
H多价5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H多价6 z39,z41,z42,z44
H多价7 z52,z53,z54,z55
H多价8 z56,z57,z60,z61,z62
每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对
检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1代-2 代后再检查如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如F :
小玻管法：将半固体管（每管约1 mL一2 mL）在酒精灯上熔化并冷至50℃ ，取已知相的H因子血清0.05 mL-0.1ml，加人于熔化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1：200-1：800的量加人。
小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热熔化，冷至50℃ ，挑取因子血清1环，加人小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，侯凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1%软琼脂斜面，于37℃ 培养后再做凝集试验
简易平板法：将0.7％-0.8％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
5.5.4.3 Vi抗原的鉴定
用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。
5.5.4.4 菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果，按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
5.6 结果报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g样品中检出或未检出沙门氏菌属。

楼主，请问你的BS感觉怎样，我使用后感觉不好用，不知为什么，黑呼呼的，金属光泽，不好分辨，和别的致病菌一样。