dickwang2008
第4楼2009/10/16
3.基质效应的评价方法
目前在生物样品分析领域中,主要有两种方法对基质效应进行评价。一是柱后流动注射法(Post-column infusion method)。下图为例:
流动注射法是一定性方法,可以考察一个方法是否存在基质效应、是抑制还是增强,但不能对其进行定量分析。这种方法简单的讲就是在色谱柱后有一个流动注射泵,能够连续不断的、以恒定速度提供待测的分析物,这些分析物进入质谱就会产生基本稳定的响应;而含有空白基质的样品由液相色谱注入,经色谱柱的保留,从柱后流出,会同待测的分析物一同进入质谱,这时就会观察到待测物响应的是否变化、变化趋势如何,从而确定选择的样品处理方法是否合适。
另一种是样品处理后加入法(Post-extraction spike method)。下图所示:
与流动注射法相反的是,样品处理后加入法是可以对基质效应进行定量计算的方法。目前国内国际学者对其计算主要分为两种:绝对基质效应(Absolute matrix effect)和相对基质效应(Relative matrix effect)。前者是通过比较待测物在纯溶液中的响应与待测物加入空白生物样品经提取处理后的空白基质中的响应二者的比值来确定;而后者则是测定不同批次的生物基质来确定,Matuszewski提出至少要考察5个不同个体的基质样品来确定基质效应。
在上述方法中,有学者建议使用低、中、高三浓度的质量控制样品(QC)来评价基质效应的大小;有人建议使用定量下限(LLOQ)水平的6个个体的基质来评价;也有人建议使用不用批次的标准曲线的样品来评价,通过计算这几个批次各个浓度点的精密度(%RSD)来确定基质效应的大小。对于使用哪一种方法更为合理,目前没有定论。这也希望各位版友能够提供你们的做法和经验,看看哪种方法更为合理。
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4.消除或降低基质效应的方法
【1】样品处理技术
总体来讲,基质效应是与生物样品处理不干净密切相关的。我们可以通过稀释处理后的溶液或者降低进样量,来降低基质效应对测定的影响,但这是治标不治本,背景噪音在降低的同时,待测物的响应也降低,对改善我们的测定灵敏度没有太大好处。其实,更为关键的是选择合适样品前处理方法。我们在生物分析中主要用到沉淀蛋白法(PPT)、液液提取法(LLE)和固相萃取法(SPE)。PPT适应于绝大多数化合物,对蛋白结合率的高低没有要求,操作步骤相对简捷,缺点就是处理后的样品不是很干净,内源性物质较多,从而产生较强的基质效应;LLE适于极性相对小、蛋白结合率低的化合物,提取步骤相对繁琐,但处理后的样品尤为洁净;而SPE根据填料的不同,适于分析的化合物的种类也有所差别,目前市面上有SPE小柱和SPE 96-well板,该方法特点是样品处理后干净,操作装置简单,绝大数的内源性物质被去除,使待测物浓缩,提高检测的灵敏度。
Sample Processing Instrument
我所进行的实验中,曾做过一个化合物A,质谱响应很低,浓度1µg/mL的纯溶液直接进样,SRM响应也就只有五六千,在这种情况下,处理样品时就首选固相萃取法,因为它能对样品进行浓缩,并能有效的降低基质效应的影响。而考虑到化合物Pka值呈弱碱性,所以选择Waters的MCX填料的萃取小柱。
当然,样品处理过程中各个洗脱容积的选择也是非常重要的。如果样品处理选择不当或者洗脱溶剂比例调节不好,那么方法的选择性就会很差,更为直观的表现出来就是不同个体的色谱图差异很大,如下图所示,
上图采用的洗脱溶剂是氨化甲醇,由3.5min左右的峰观察,内源性物质较多。同时,我们采用该方法,对基质效应进行了考察。方法为:选择6个不同来源的血浆样品,配制成LLOQ水平的样品,每个个体平行处理三份,然后进行分析。但结果显示,个体间的差异很大,并且已超出了规定的接受标准,这个也可以由上图直观的看出,因此我们对样品预处理方法进行了优化,并重新选择了洗脱溶剂。当采用新的处理方法后,依然对基质效应进行考察,6个不同来源的个体差异很小,见下图,并且选择性结果符合要求。
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【2】色谱条件的优化
基质效应的产生,是由于内源性物质与待测物一同流出色谱柱,从而产生竞争抑制引起的。优化色谱条件,改变内源性物质与待测物在色谱柱上的保留时间,使其流出的速度不同,从而进入质谱的时间不同,这样就可以去除或降低基质效应的影响。比如待测物易离子化,那么调节样品或溶液中的PH值,会对它的保留、选择性和灵敏度产生很大的影响。
请看下面两图,色谱条件优化前
色谱条件优化后,
从优化后的色谱图中,可以看出在4.2min左右有部分内源性物质的小峰出
现,这说明如果化合物在这时候被洗脱下来,那么内源性物质就会一同下来,同时进入离子源,从而产生基质效应。为了避免这个问题,我们优化了色谱条件,将洗脱程序变缓,使内源性物质和待测得化合物分开,这样就减小了基质效应。