【求助】急！异硫氰酸苯酯（PITC）衍生测18氨基酸方法求助

seatop

2010/10/28

私聊

液相色谱（LC）

最近在用异硫氰酸苯酯（PITC）检测氨基酸的时候出现了一个怪问题：
17个氨基酸只有前面9种氨基酸可以出峰，剩下的氨基酸都不能出峰。液相条件什么都是一样的，换了新柱子问题仍然存在。
一开始怀疑由于现在天气凉了衍生不充分，就放在25℃水浴中衍生2小时，问题仍然存在。
让我很是苦恼。调整梯度程序、温度都不管用。液相也很正常。

下面是我的液相条件：请各位高手帮忙啊！

5色谱条件

色谱柱: Sepax AA专用柱，4.6*250mm，由苏州赛分科技有限公司提供。

检测波长:254nm。

柱温:40℃。

流动相A: 醋酸钠溶液：乙腈=93:7 （V/V）。

流动相B: 乙腈：水=4:1（V/V）。

进样量:5ul

流速:1mL/min

(注：分析结束后使用20%乙腈水溶液清洗，再用100%乙腈清洗后储存)

表1 梯度洗脱程序
时间/min	流动相A/%	流动相B/%
0	100	0
2	100	0
14	93	7
29	70	30
32	50	50
33	0	100
39	0	100
39.1	100	0
45	100	0

6 氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生(设2个重复)

6.1 17AA衍生

准确量取氨基酸标准溶液400μl，置5.0ml塑料离心管中，加入三乙胺乙腈溶液(2.10)200μl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液(2.11)200μl，混匀，室温放置1小时，然后加入正己烷800μl，振摇后放置10分钟，取下层溶液(PTC-AA)，用一次性注射器吸取上清液用0.45μm针式过滤器过滤。

准确量取样品溶液400μl，置5.0ml塑料离心管中，加入三乙胺乙腈溶液(2.10)200μl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液(2.11)200μl，混匀，室温放置1小时，然后加入正己烷800μl，振摇后放置10分钟，取下层溶液(PTC-AA)，用一次性注射器吸取上清液用0.45μm针式过滤器过滤。(PTC-AA，密闭，4℃，可保存24小时)

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