【分享】浅谈高效液相色谱分析中常见问题及对策

高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。样品通过进样系统注人色谱分离柱，在柱内进行分离。柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]，从而完成整个分析过程。
　　液相色谱仪的色谱分离是依靠色谱柱进行的。研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相（液相和固相）中分配“平衡”的过程。液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。当液体样品在载体流动相的推动下，在液一固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数（K）不同，则使各白的移动速度不同，即产生差速迁移。各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。

上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中，由于在两相中浓度的不同、而存在分配系数上的差异。
　　既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因，那么，必然地也会同色潜理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系，事实上，色谱理论中通常用容量因子k’的概念来反映物质在两相中的分配关系：

k’值可以非常方便地表达组分在两相的分配，又很容易从色谱实验数据中直接测得，是色谱理论中重要的基本参数之一[2]。
2 输液泵的常见故障及对策
　　输液泵/高压泵是保证HPLC系统流路畅通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件，日前多用往复式恒流柱塞泵，主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成，用马达带动凸轮驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。常分为单柱塞泵、并联柱塞泵、串联柱塞泵和柱塞隔膜泵等类型。流动相混合方式分为低压混合和高压混合。常见泵的故障主要有以下几种，并提供解决的办法。
2．1 单向阀故障 由于球与阀座密封不严，液体倒流，造成压力不稳，甚至球与阀座粘在一起阻死。密封不严主要是污染或气泡引起，球与阀座粘连也是由于污染和磨损造成。
　　为避免单向阀中的宝石球和阀座被污染，流动相应使用HPLC级的溶剂，并且配好的流动相一定要用0．45u滤膜过滤和脱气。如果泵被微粒污染，可分别用水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷依次冲洗。冲洗时应打开泄液阀，最后再用所用的溶液冲洗整个系统。
　　气泡进人阀中会紧贴在阀体的一侧，使宝石球难返回到阀座，引起倒流，泵的压力和流速会明显改变。此时，应立即打开泄液阀，大流量（2ml/min）冲洗泵，直至排除液为直线型。因为甲醇可润湿泵内壁，挤出气泡，故也可使用脱过气的甲醇冲洗泵。长期不用的泵或新装的泵头应该用甲醇赶气泡。泵进气泡也可在泵头上排气泡，即用扳手固定住进气泡的泵头，拧开输出管道的压帽，手动泵送液，可见到气泡从孔中挤压出来，直至无气泡排出将压帽拧紧[3]。
　　采取上述办法仍不能使压力稳定，应考虑是否密封垫坏了?或单向阀磨损、球不光滑等，需更换部件。

2．2 泵垫圈故障 泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统。液相色谱系统一般情况下不要使用强酸强碱溶液，因为这会损坏密封垫和柱塞杆。密封垫圈与运动着的柱塞杆紧密接触，可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来，它是液相色谱系统中最易磨损的部件。有条件的实验室可三个月更换一次垫圈，防止泵系统污染。如果用缓冲盐作流动相则更会加速垫圈的磨损，应及时冲洗。当垫圈损坏时，表现为：泵压力不稳、泵头漏液。一旦出现这个现象，应尽快更换新垫圈。
　　为避免上述故障的发生，我们在分析工作中应注意以下几点：
　　①使用超纯水（18MΩ．cm）、纯度级别较高的试剂和色谱级溶剂配制流动相；
　　②配好的流动相一定要抽滤脱气，即便仪器有在线脱气装置，也最好在卜机前进行抽滤。真空抽滤既过滤颗粒也脱了气泡，非常有效。
　　③泵在起动前一定要通过泄液阀抽净泵里的空气。
　　④用缓冲盐洗脱时，分析结束后一定要用水冲洗泵和整个流路系统，不要让腐蚀性溶液滞留泵中，最后用有机溶剂充满系统。

色谱分离柱的使用与维护
　　作为HPLC分离过程的核心，稳定高效的色谱柱和固定相是建立适应范围广、重现性好的分析方法的基本保证。色谱柱在使用过程中常出现的问题主要涉及到：色谱柱的寿命、保留时间与分离度的重现性，色谱峰脱尾等。
3．1 色谱柱的寿命
　　色谱柱使用过程中，会由于各种原因导致分离失败或色潜柱失效，主要表现有：色谱柱反压增高、峰脱尾、塔板数下降、保留值降低等。造成这些问题的原因主要有柱滤板问题、强保留组份影响和化学影响等，下面将分别讨论：
3．1．1 色谱柱滤板问题及对策
　　色谱柱入口筛板堵塞是色谱柱最常见的问题之一，筛板堵塞会导致柱压升高，色谱峰脱尾、塔板数降低。注射样品中含有微粒杂质，最有可能堵塞色谱柱入口，降低柱寿命，故要在注样前，将样品过滤或离心；进样器与泵密封垫的磨损也会带来微粒，故可在进样阀与色谱柱之间用在线过滤器，常可避免色谱柱滤板堵塞问题。当筛板部分堵塞或进口处填料塌陷形成异常峰形时，可用强溶剂反冲色谱柱（低速）。如不见效，则需更换筛板，或重新填补填料后更换筛板。
3．1．2 强保留样品组份影响及控制
　　强吸附性的样品组分吸附在柱头填料上，能严重地缩短色谱柱寿命，在分析生物体液（如血液、尿液）时尤为突出。这时，可在色谱柱加一保护柱，能够有效减少强吸附组分的污染。保护柱（预柱）是根内装填料与分离柱性质相近的短柱，接在分离柱之前，可代替流路过滤器。保护柱的作用是吸附强保留组分，收集和阻塞化学垃圾进人分离柱，这些垃圾如果直接进人分离柱会逐渐堆积在柱头，最终降低柱效能。保护柱是消耗品，如分析血浆样品，一般分析50个样品后需更换新柱芯。另外，每次分析结束后可用强溶剂冲洗分离柱（应卸下保护柱），以除去可能吸附在分离柱柱头的污物，有效延长色谱柱的使用寿命。

3．1．3 压力的影响
　　色谱柱使用过程中。目前色谱分析中使用的色谱柱都能承受得起高压，但骤然压力波动，机械撞击和温度变化都会对色谱柱床产生影响，改变柱床体积，降低柱效。引起压力波动的原因主要有：进样器的样品阀的缓慢转动、泵启动太快、柱切换等操作。用手动进样阀时的压力变化不大，自动进样阀由于切换较慢，可能会造成压力冲击。在低压下操作，可大大减少由于压力波动造成的分离度的损失。
3．1．4 化学影响
　　在分离过程中色谱柱固定相的流失会显著降低柱的使用寿命，应避免使用对固定相浸蚀性强的固定/流动相组合。短链硅烷基基团反相柱稳定性最差，在低PH条件下可很快流失有机相，而长链烷基反相柱（C18，C8）较稳定。
　　我们应合理选择分离柱。选择色谱分离柱主要根据两点，一是根据待测组分的分子量的大小，二是根据流动相条件，包括PH值、离子强度和溶剂极性等。完全羚化的硅胶基质的键合相柱，其表面的硅经基分布均匀单一，稳定性好，通常要求流动相PH值在3-7之间，极端PH值（<2或>8）的流动相会溶解硅胶，使键合相流失。而目前利用先进的杂化颗粒技术研制的高纯硅胶颗粒填料（如Waters公司的XTerra色谱柱），集硅胶和多孔聚合物填料的优点为一体，使有机硅烷单元取代了相当一部分占据颗粒内部和表面位置的硅经基，使这种新型填料具有分辨率高、稳定性强、PH范围宽（1-12）的优势，其性能突破了传统高效液相色谱柱的极限。所以一定要根据分析的对象、流动相的条件选择合适的分离柱，茫然时可向公司的技术人员咨询。

3．2 保留时间与色谱柱选择性的关系
　　由于色谱柱不同硅胶基质的物理化学性质存在差异，如比表面积、孔径、纯度等，以及键合相存在交联与If=交联、密度和封尾程度的差异，会使官能团相同（C18，C8 ），键合相不同的色谱柱的保留值发生变化。硅胶基质表面积增加，则有机固定相的量也增加，使保留值提高；非交联型键合固定相色谱柱的重现性好于交联型键合固定相色谱柱；致密键合填料比低硅烷浓度键合相的重现性好，也更稳定；硅烷化条件的不同也会导致不同品牌键合相之间保留行为的不同。
3．3 色谱分离条件与保留值的关系
　　在实际分析过程中，除了色谱柱不重复带来的问题外，流动相、流速、进样量、温度等因素均会色谱柱分离性能的差异。如缓冲液的选择和配制不正确，导致保留值重现性不好，流速的变化、基线漂移、柱反压波动大，对色谱杜的性能均有影响。进样量过大能引起柱超载，使峰的保留时间降低，一般内径约4．6mm色谱柱的进样量为10-50μg。当使用自动进样时，应保持环境温度的恒定，避免柱温的波动，引起保留时间的不稳定。色谱柱在使用过程中，保留时间和分离度会随使用时间的延长而逐渐降低，可通过调整流动相的溶剂强度恢复分离。

3．4 谱峰脱尾及处理办法
　　色谱分析中经常见到色谱峰脱尾现象，特别是用过的柱子，其主要是：柱效下降、筛板堵塞、床体塌陷、柱头污染、进样超载、流动相不匹配、柱外效应等。为防止柱头堵塞污染，使用中最好加保护柱，如果柱头被污染，可用强溶剂反冲色谱柱，会恢复一定的柱效。样品最好用流动相稀释，防止谱峰变形，样品沉淀和大溶剂峰。与高效液相色谱仪有关的柱外效应，如：流路的管线过长、检测器流通池的体积过大，也会使峰性脱尾，应尽量选择细内径的短连接管、小体积检测池。另外，流动相中加人三乙胺等改善剂可消除流动相固定相与样品之间的不匹配，改善峰型。
3．5 日常工作中怎样维护好色谱分离柱?
3．5．1 及时冲洗分离柱。每次分析工作结束时，冲洗完缓冲盐后，最后要过度到用强溶剂冲洗柱子，如可用色谱纯甲醇、乙睛冲洗反相C18柱，目的是冲去吸附在柱上的强保留组分。如果用甲醇/水为流动相也应这样冲洗柱子，在一定程度卜可恢复柱效；定期冲洗和再生柱子。
3．5．2 做好样品纯化，最大限度减少柱的污染。我们在多年的分析工作中发现，凡是样品纯化的越干净，分离柱的寿命就越长；反之，只有提取没有纯化的样品，分离柱柱效下降较快。建立一个理想的色谱分析方法应该有一套有效的样品前处理方法，特别是在分析血浆和尿液样品时，要特别注意样品的提取与纯化，尽量使处理过的样品中杂质（如大分子蛋白、有机物等）降到最低，保护柱头和柱子。
3．5．3 提取纯化好的样品最好用流动相来溶解，一方面减少色谱图中的溶剂峰干扰，另一方面也是检查样品在流动相中的溶解性，如果样品进样后在流动相中沉淀，会堵塞进样器和柱头，甚至样品分解，出现怪峰。如果出现样品与流动相不溶要设法改变溶解条件，如更换样品溶剂，或改进处理样品的方法，或过滤，去除不溶性物质。

4 检测器的常见故障及对策
　　液相色谱仪常用的检测器主要有紫外、荧光和电化学检测器。这些检测器的作用就是收集流经色谱分离柱的各组分在检测器中的信号，根据组分光吸收值/荧光强度/电极表面电流的变化计算出组分的浓度。各检测器常见故障主要有：
4．1 基线噪音较大和时策
　　对于紫外检测器，氖灯光源打开后要预热30分钟以上，基线才能稳定。
　　氖灯用的过久，接近受命期时（氖灯的寿命约束1000小时），会使基线噪音明显增加，应及时更换氛灯。除光源外，流路中的气泡也会产生噪音。怎样判断基线噪音增大是由于光源灯的老化还是来自流路中的气泡?可将泵关匕继续走基线，如果噪音立即停止，基线呈一条直线，说明基线噪音来自流动相中的气泡，应设法排气；若停泵后仍有噪音出现，应考虑是灯的问题。
　　电化学检测器中的工作电极（安培型）对气泡十分敏感，仪器的平衡时间较长。流路中如果有气泡存在，不仅基线会出现尖峰，还会影响检测。因此，做电化学检测时，流动相的配制要很严格，水要超纯、除还原物，配好后一定要过滤脱气，还应现用现配。如果泵系统不是YK材料，即电化学分析专用仪器，而是普通的高效液相色谱不锈钢泵，应对系统中的不钢材料的输液泵、进样器和管道，在分析前用6moUL硝酸溶液钝化（注意断开分离柱），可缩短基线平衡时间。还可在流动相中加入EDTA离子隐蔽剂，也是可以的。如果有较大的气泡进到检测器中，光靠泵冲有时太慢，可暂时将泵停止，关上电化学检测器，拆下工作电极，用超纯水冲洗电极表面，也很奏效的，但对液相色潜技术不太熟练的技术员要小心操作，不宜反复这样拆卸。