【在线讲座71期】电致化学发光原理及应用——时间：2011年5月17日-5月24日

2． 电致化学发光的主要体系
2.1 鲁米诺
Vojir等在1954年首先在滴汞电极上观察到了鲁米诺在碱性条件下的电致化学发光现象。随后，在Pt电极上也同样观察到了鲁米诺的电致化学发光。通常情况下，鲁米诺都是在碱性条件下，有过氧化氢存在时发生电致化学发光反应。可是目前对于鲁米诺电化学发光反应机理仍然尚未形成统一的认识，但鲁米诺及其衍生物（主要有异鲁米诺、4-氨基已基-N-乙基异鲁米诺、N-(4-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺(AHEI)和N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)等）作为电化学发光最常用的发光标记物质之一，得到了广泛研究。与化学发光反应类似，一些高价金属离子以及酶（如辣根过氧化物酶，HRP）等物质，也可以做为鲁米诺与过氧化氢体系电化学发光的催化剂，电化学发光反应中会放出波长为425 nm的光。此外，鲁米诺体系在有机相，比如二甲基亚砜（DMSO）中也会产生电致化学发光，不过此时释放的光的波长是490 nm。

鲁米诺的电致化学发光机理与经典的离子湮灭以及共反应物电致化学发光系统都有不同。首先，在鲁米诺体系中并没有氧化和还原的鲁米诺物质；其次，鲁米诺自身也会在电极表面被直接氧化并发光；再次，一旦被氧化，鲁米诺在发光后不能再生。

Chu等研究了中性溶液中反应氧对鲁米诺电化学发光强度的影响，结果显示，反应氧无论是溶解于溶液中还是固定在常规的电极表面，都可以显著增强鲁米诺的化学发光信号。不过在碱性溶液中得到的光比在中性溶液中得到的光的强度更强。用纳米粒子修饰的电极能将光强提高2-3个数量级。Wang等用银纳米修饰的金电极作为工作电极，结果表明，无论在中性还是碱性溶液中，鲁米诺在银纳米修饰的金电极上都可以产生很强烈的发光，并且重复性良好。纳米粒子的大小和性质，以及电极本身的性质都会对电致化学发光反应产生影响。电致化学发光信号的增强可能是由于电极面积的增加，以及纳米粒子对鲁米诺氧化的催化效应。

2.2 三联吡啶钌
当前电化学发光领域使用最多的发光物质是三联吡啶钌[Ru(bpy)₃]²⁺及其衍生物。它具有水溶性好、稳定性高、发光效率高、检测灵敏度高、线性范围宽以及可以重复使用等优点。采用三联吡啶钌做为电致化学发光的发光物质时，通常使用三丙胺（TPA）或草酸根离子做为共反应物，反应会放出波长为620 nm的光。罗氏公司用于免疫分析的电致化学发光仪器采用的就是三联吡啶钌/TPA电致化学发光体系，已经在医院得到广泛使用。

Yin等分别以3种氨基乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、氮三乙酸(NTA)和羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)作为Ru(bpy) ₃²⁺的共反应物，研究其电化学发光，这三种共反应物对钌的检出限分别为1、60和680 fmol/L。在最佳条件下NTA激发钌的电化学发光效率显著高于TPA，并且与TPA相比，NTA毒性小、腐蚀性低、不易挥发，可以得到广泛地应用。
2.3 纳米材料和量子点
纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围（1-100 nm）或由它们作为基本单元构成的材料。量子点是准零维的纳米材料，由少量的原子所构成。粗略地说，量子点三个维度的尺寸都在100纳米(nm)以下，外观恰似一极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应特别显著。
Ding等首先报导了Si纳米材料的电致化学发光，此外，CdSe/ZnSe、CdSe等量子点在有机溶剂中也具有良好的电致化学发光特性。纳米材料的电致化学发光有一个普遍的特征：相对于光致发光，纳米材料的电致化学发光光谱的峰值波长会发生显著红移。此外，金纳米颗粒修饰在金电极的表面可以改善吸附能力，提高检测的灵敏度。
2.4其它体系
碱性溶液中，光泽精在过氧化氢的存在下，会产生电致化学发光，一些过渡金属离子对此反应具有催化作用。然而光泽精电致化学发光反应的产物的水溶性比较差，容易吸附在电极表面，造成电极的污染，影响发光反应的灵敏度和重现性。
吖啶酯类化合物同样在有过氧化氢存在下的碱性溶液中产生电致化学发光。吖啶酯类化合物同时也是一种标记物，在免疫方面以及作为DNA的发光探针都得到了应用。
过氧化草酸酯类化合物在一定的条件下也可以发生电致化学发光。过氧化草酸酯类化合物在过氧化氢的存在下会生成一个高能量的中间体，此中间体会将一部分能量传递给附近的荧光物质，最终使荧光物质发光。然而由于在试剂的溶解性、稳定性方面的原因，过氧化草酸酯类化合物在电致化学发光方面的应用比较少。
3． 电致化学发光的应用
3.1电致化学发光在分析方面的应用

Yang等研究了ABEI在+1.0 V(Ag/AgC1)氧化电位的碱性溶液中可以发光，加入H₂O₂可以显著增强其化学发光的强度，溶液的pH值、H₂O₂的浓度和工作电位都对电化学发光的响应度产生影响。在最佳条件下，ABEI的检测范围为1.3×10^-6 ～6.5×10^-12 mol/L，ABEI的检出限为2.2×10^-12 mol/L（S/N=3）。

Xue等用Ru(bpy)₃²⁺／DBAE(2-(二正丁氨基)乙醇)体系检测了多巴胺，其检测线性范围为5×10^-10 ～7×10^-7 mol/L，检出限4.0×10^-11 mol/L。EDTA含有两个三级胺，可以与Ru(bpy)₃²⁺发生强烈的电致化学发光。此外，EDTA又可以与很多金属离子形成配合物，因此通过电致化学发光可以对金属离子进行检测。

电致化学发光也可以用于环境分析，可以对环境水源以及饮用水中的寄生虫、细菌和有毒化合物进行测试。隐孢子虫是水中的一种寄生虫，会引起肠胃疾病，由于它的可感染剂量很低，需要非常灵敏的分析方法。电致化学发光标记的免疫方法可以对主要在水中发现的隐孢子虫卵囊进行检测，采用三明治结构的电致化学发光免疫分析可以直接检测污水和下水道样品中的卵囊。 大肠杆菌和沙门氏菌也会引起严重的肠道疾病，是饮用水中很容易存在的污染物。电致化学发光免疫方法可以对环境水和食品洗涤物中的大肠杆菌E. coli O157和鼠伤寒沙门菌进行检测，具有很高的灵敏度。

食源性致病菌的检测在食品工业中产品中污染物的筛选，以及公众健康中疾病爆发的来源和原因的分析中都是一个得力工具。目前的方法要得到结果需要2-4天的时间，而电致化学发光分析能够更迅速地提供结果，同时由于它对多种基质具有高容忍度，更适于进行食品检测。除了可以检测食品中的大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌，电致化学发光分析还可以检测金葡菌肠毒素。金葡菌肠毒素也是食物中毒的一个主要原因，由于它的毒性很高，可以被用作生化武器，因此需要一个灵敏的方法对其进行检测。电致化学发光免疫分析利用抗体的特异性可以对肠毒素A, B, C1, C2, C3, D和E进行检测，灵敏度达到了食品工业和细菌站检测的要求。

有的药物对鲁米诺电致化学发光反应具有催化或者抑制的作用，基于这个原理，可以对甲磺酸培氧氟沙星、氨苄西林以及酚羟基类药物进行检测。对于一些含有三级或二级胺基团的药物，由于具有强还原性或者在反应中能生成强还原性的中间体物质，可以和Ru(bpy)₃²⁺产生电致化学发光，目前用这种方法已经检测了利多卡因、布比卡因、阿米替林、多赛平等局部麻醉药和抗抑郁药等。

3.2电致化学发光在免疫的应用
免疫分析研究的物质基础是抗体和抗原,对抗原和抗体进行特殊标记是免疫技术的关键。免疫检测法具有快速、灵敏、选择性好等特点，被广泛应用于临床诊断、法医学、药物学和环境科学等领域。目前常规的免疫分析方法主要有：荧光免疫分析、放射免疫分析和酶联免疫分析。然而，时间分辨荧光免疫法有光的散射和杂光的干扰等问题；放射免疫技术存在放射性污染的问题；酶联免疫技术虽然避免了放射污染,但灵敏度却未达到放射免疫技术的水平。
电致化学发光免疫分析技术(ECLIA) 是利用电化学发光剂作为标记物标记抗体或抗原而形成稳定的复合物。当这种复合物与被检测物中对应的抗原或抗体结合后，在加电电极的作用下激发出特异的光，根据发光的强度可检测出被测物的浓度等参数值。ECL 免疫分析分为直接法、双夹心法和竞争法等三 种方法,其中直接法主要用于检测抗体,双夹心法主要用于测定大分子抗原,竞争法主要用于测定小分子抗原。与荧光、放射和酶联等常规的免疫技术相比, ECLIA 具有以下优点: (1) 无放射性辐射危害;(2) 灵敏度高,检测线性范围在6个数量级, 达到或超过放射免疫技术水平; (3) 检测线性范围快,检测仅需几分钟到十几分钟; (4) 稳定性好,自动化程度高; (5) 应用范围宽,既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体,又可用于核酸探针的检测 。
Arail等报道了检测hIgG的灵敏方法，以ABEI标记hIgG抗体，hIgG和ABE1．hIgG抗体进行免疫反应形成刚硬结构，可以显著增强电化学发光的强度。在此基础上可以检测加入的hIgG的浓度，检出限为8.0 ng／L(S/N=2)，这种检测方法的灵敏度和准确性远超过了当时常规的检测方法。
Xu等用Ru(bpy)32+ 标记前列腺特异性抗原(PSA)进行电化学发光。研究表明：发光强度和PSA的浓度成正比，而与其质量和大小成反比。当加入PSA抗体与其免疫反应后，由于形成的免疫复合物使其质量和大小增加，发光强度降低，据此可以得到不同类型的PSA抗原与抗体的结合力，然后由结合力的大小可对抗原进行筛选。
磁微球是以金属或金属氧化物为核，外面包被带有活性基团物质的一种新型生物分离材料。目前制备磁微球的方法有包埋法、聚合法、浸渍法、挤压法和生物合成法等免疫磁性分离技术是利用抗原抗体的高度特异性识别作用，使抗体（或抗原）固定于磁微球表面，形成固相抗体/抗原的复合物，经外磁场作用后，复合物被滞留，从而达到与其它组分分离的目的。也可以同时采用链霉亲和素-生物素包被技术，在磁微球的表面最大量地包被上链霉亲和素，先与不同抗原或抗体的生物素试剂合成链霉亲和素-生物素包被，再与标记物一起形成高亲和力的结合物，使得检测更加灵敏。

3.3电致化学发光成像法的应用
Engstrom等认为电致化学发光强度对电极表面的活性具有很大的依赖，利用电致化学发光成像法观察电极表面电致化学发光强度的分布，可以直观地反映电极表面的活性分布。实验结果表明碳糊电极表面存在着活性区域和非活性区域。
Bard等发现电致化学发光强度与工作电极和对电极之间的距离在一定范围内呈线性关系，提出可以利用电致化学发光法表征电极表面粗糙度的方法，即通过精密的仪器控制超微电极在所研究的电极上扫描，同时记录电致化学发光强度与电极所处位置的关系，根据电致化学发光强度变化的情况间接反映出电极表面的粗糙度。
还可以通过电致化学发光成像法对电致化学发光过程进行跟踪，由电致化学发光强度分布随时间变化的情况推断出在电极表面产生的试剂的走向，从而考察微区中溶液的流动情况。
此外，通过电致化学发光成像法还能进行固态电子传输和电子转移机理，以及进行反应动力学方面的研究。

我看到说可供发光的试剂目前比较有限。
那么我想问是不是化学发光目前的应用范围还是有局限性的，主要应用在哪些方面？

paulwong119老师：您好！我有以下问题想请教，
请问：电化学发光一般在实验室哪些方面能够应用的到，感觉应用的不是很普及。

paulwong119老师：您好！我有以下问题想请教：

“Chu等研究了中性溶液中反应氧对鲁米诺电化学发光强度的影响，结果显示，……不过在碱性溶液中得到的光比在中性溶液中得到的光的强度更强。”

鲁米诺物质不参与氧化还原反应，那就是说反应氧起到的是催化作用，对不对？
如果是催化作用，这么说在碱性溶液中反应氧更易存在？那它有没有参与电极反应？
如果参与了反应，这个反应中的电极应该是惰性电极吧？碱性条件下，应该是消耗氧气的，这样的话就不足以提供氧促进其反应，进而发光强度不可能再碱性条件下更强啊？？

不太明白，请问，在这个实验中反应氧的作用？有没有参与电极反应呢？

我也想问一下，电致化学是不是用在生物研究或者生命研究领域比较多一些？

paulwong119老师：您好！我有以下问题想请教：

“Ding等首先报导了Si纳米材料的电致化学发光”

我想知道在这个实验中作者有没有做应用？是用来标记细胞等用来生物分析吗？

量子点好像可以直接用于标记细胞，在合适的激发光下可以发射出相应的光

不知道这个实验中的应用跟量子点直接标记细胞有什么区别？

paulwong119老师：您好！我有以下问题想请教：

paulwong119老师，其实我还有个问题，问的太多了，不太好意思了

关于量子点与纳米材料的区别：
我的理解是“并不是所有的纳米材料都是量子点，而量子点一定是纳米材料？？”
是不是所有量子点都能用来标记生物样品？？