Q8.引物(含修饰)的分子量是如何确定的?
非修饰的引物的分子量(MW)在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5,引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量,或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)+(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns-62.
NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量,WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数,例如G+A混合的分子量为(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量
Base | Molecular Weight |
A | 313.21 |
C | 289.18 |
G | 329.21 |
T | 304.19 |
I | 314.2 |
U | 290.17 |
常规修饰基团分子量5’-Biotin | 405.45 | 3’-TAMARA | 623.60 |
5’-(6 FAM) | 537.46 | 3’-Dabsyl | 498.49 |
5’-HEX | 744.13 | 3’-(6 FAM) | 569.46 |
5’-TET | 675.24 | 3’-Amino Modifier C3 | 153.07 |
5’-Cy5 | 533.63 | 3’-Amino Modifier C7 | 209.18 |
5’-Cy3 | 507.59 | 3’-Thiol Modifier C3 | 154.12 |
Q9.如何溶解引物?干燥后的引物质地非常疏松,开盖前最好瞬时离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE(pH8.0)缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。Q10.如何保存引物?引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。干 粉:运输时常温运输,-20℃可以保存一年。储存液:配好后分装成几管,避免反复冻融,-20℃可以保存半年。工作液:常规使用,4℃保存,也可-20℃保存,但应避免反复冻融。修饰荧光引物:需要避光保存,尽快使用为宜。Q11.最长可以合成多长的引物?我们合成过100base的引物,但是产率很低。除非需要,建议合成片段长度不要超过80base。引物越长,出现问题的概率就越大,按照目前的引物合成效率,大于80base的粗产品,全长引物的百分比不高,后续处理还有丢失很多,最后的产量很低。Q12.为什么修饰引物的产量要比一般引物低,价格要高?主要因为是修饰单体稳定性较差,偶连时间长,效率低,最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化,纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍,所以产品的价格也高。Q13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?连接反应需要引物的5'磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。Q14.为什么引物的OD260/OD280小于1.5?需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。下表是一个20base同聚体引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions |
Base Composition | A260/280 |
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 | 2.50 |
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 | 1.85 |
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 | 1.15 |
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 | 1.14 |
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 | 1.66 |
Q15.同样的OD用PAGE检测,EB染色为什么深浅不一?通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同,形成二级结构的可能性不同,EB的染色程度也会有差异,比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量,而用紫外分光光度计检测。Q16.如何检测引物的纯度?实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用银染方式染色。Q17.已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。