省部重点实验室
第1楼2011/11/09
二、 预实验阶段
按照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验,每个样本做一个10倍和100倍稀释的实验,预实验的目的主要有两个,一是了解样本的模板浓度范围,如果有样本的模板浓度在标准曲线之外,如过高或过低,则可能要对标准曲线进行重新优化,当然,如果过高和过低不影响你的实验结论则可定为高于多少或低于多少,直接进行外推是不科学的。另一个目的看样本中是否有PCR抑制物的影响,如果每个样本的定量结果与其10及100倍稀释后的样本的结果相同,则表明没有抑制物的影响,如果不同,如原倍结果为零,而10及100倍稀释后的样本的结果为阳性,则表明样本中PCR抑制物浓度较高。可用其10及100倍稀释后的样本进行定量。
有几个用户发现过实验为阴性的样本在其10及100倍稀释后的样本为阳性的,也许有更多用户没有进行这样的实验,得到了错误的结论。因为样本RNA的提取试剂中经常有抑制PCR反应的物质,清洗不干净就会影响到定量PCR反应。
三、 正式实验阶段
然后就可以进行正式实验了,只需要将每个样本作三个或更多的重复即可以了。有抑制物的样本先进行稀释,计算浓度时不要忘记就行了。最后就可以进行实验结果分析了,个别样本中离群的数值可以删除。
Sybr Green法的注意事项
1、 最好按照上面提到策略进行实验,以免造成不必要重复实验,从而降低实验成本
2、 Sybr Green I一般是先将母液用DMSO进行稀释100倍,最终的使用浓度为4000-10000分之一。可能不同的Sybr Green I母液的稀释倍数不同,可通过实验来证明,但高浓度的Sybr Green I肯定会影响PCR反应。另外用水稀释后的Sybr Green I保存的时间很短,一般1周后就不能用了。DMSO似乎反复冻融会影响性能,但原因不明。
3、 在对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化后仍得不到满意的结果,特别是引物二聚体很多时,可以考虑更换引物,因为引物成本低,而优化实验成本很高。
4、 当有少量引物二聚体影响荧光结果时,可以提高荧光读板时的温度来消除引物二聚体的影响,如将读板时的温度提高到82度,此时引物二聚体已经解链而产物没有解链。但引物二聚体浓度很高时会严重影响PCR反应,消除引物二聚体的影响也没有用。
5、 大家都知道进行绝对定量需要标准曲线,有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了,可以通过2ΔΔC(t)来计算,但这一计算是有条件的,即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%,可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2ΔΔC(t)来计算了。这是错误的,会得到错误结论。
6、 无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒,最好买够试剂,以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂,由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别,如有的试剂中含有DMSO及Mg2+离子等,可能会影响到实验结果,甚至要重新进行实验条件的优化。
7、 不要在管盖上写字,原因很明显,但有些用户习惯了写字,后来再擦掉,也会对实验有些影响。
8、 最好使用高质量的PCR管,低质量管的管间差可能会很大。
9、 每次实验一定要有阳性对照和阴性对照,以免出现问题时找不到原因。
10、 在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量。只要浓度不是太低,理论来讲对稀释是不会影响实验结果的。
其他方法也可以采用类拟的策略,以节约成本,提高效率。
想到的内容就这些了,希望大家多批评指正。
反应体系的建立及优化
来源: 作者: 发布时间:2008-10-17
1. SG浓度:
终浓度1:5,000-1:100,000,一般为1:10,000—1:70,000
2. Primer浓度:
终浓度50nM-300nM
固定摸板浓度的梯度实验
不加摸板的对照实验(NTC)——有无非特异信号
熔解曲线的分析——是否单峰
建议使用HPLC纯化的引物
3. MgCl2浓度
降低MgCl2浓度以减少非特异性产物
最低可至1.5nM
同时做梯度实验和NTC对照
4. 反应温度和时间参数
反应温度参考所用酶的种类
退火温度使用温度梯度功能优化
反应时间与常规PCR类似,扩增片断一般为200-300bp
5. TaqMan探针
引物、探针设计:
首先选择探针序列
探针的Tm值为68-70度,长度不应超过30碱基
探针的5’端不应是G,G有可能会淬灭荧光素
引物应尽量靠近探针,扩增片断不超过400bp,通常为80-150bp
引物的Tm值为59-60度,长度约20碱基
避免引物、探针之间的二级结构
委托合成公司设计
使用辅助软件
确定反应参数
一般为两步法,94度10-20s
60度30-60s (Taq酶的5’外切酶活性在60度最强)
通过温度梯度优化退火温度
三步法, 72度45s
优化引物探针浓度
目标:最高的信号/背景比
最小的Ct值
引物浓度:50nM-900nM
探针浓度:50nM-250nM
通过多次实验确定各自的浓度和比例