十三.流式细胞术在血液学中的应用 淋巴瘤免疫分型
目前淋巴瘤的分类方法已从LSG的形态学分类逐渐转变为REAL分类法, REAL分类法是以肿瘤发生源为基础的分类方法,在原来的形态学基础上加上免疫学分型后再加以分类,这种分类方法不仅能够推断肿瘤的发生源,对治疗也有指导意义。因此淋巴瘤的免疫分型越来越重要。如同白血病免疫分型一样，淋巴瘤的免疫分型也是利用单克隆抗体检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测淋巴瘤细胞所属细胞系列及其分化程度。流式细胞仪能对多数的淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原迅速客观地做出检测，在淋巴瘤的免疫分型中起着不可替代的作用。
临床淋巴瘤的免疫分型的检测标本一般是淋巴结、脾脏、胸水、腹水等。在临床淋巴瘤的免疫分型工作中常可遇到以下四种情况：①B细胞系淋巴瘤②T/NK细胞系淋巴瘤③淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤④造血细胞以外的肿瘤。
REAL分类淋巴瘤的免疫表型见表12.8。*：弱表达或阴性。
BLBL :前B原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病; BSLL: B-小淋巴细胞淋巴瘤; LPL:淋巴浆细胞样淋巴瘤; MCL: 斗篷细胞淋巴瘤; FCL:滤泡中心淋巴瘤; MZL: 边缘带B细胞淋巴瘤; SMZL :脾MZL ;HCL:毛细胞白血病; PC:浆细胞瘤;DLBL: B-弥漫性大细胞淋巴瘤; BL: Burkitts淋巴瘤; HBLB:高度B细胞淋巴瘤, Burkitts样; TLB L: 前T原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病; TPLL: T幼淋细胞白血病; LGLT:大颗粒淋巴细胞白血病, T细胞型; LGLNK: 大颗粒淋巴细胞白血病, NK细胞型; MF:覃样真菌病; PTL:外周T细胞淋巴瘤,非特异;AILD:血管免疫T细胞淋巴瘤;ACL:血管中心性淋巴瘤; ITCL:肠T细胞淋巴瘤; ATL:成人T细胞淋巴瘤/白血病; LCL:大细胞淋巴瘤; LCLH: 大细胞淋巴瘤,何杰金氏样;
1． B细胞系淋巴瘤 大多数情况下, B细胞系淋巴瘤CD19、CD20阳性，分化早期CD20阴性，CD10、CD34阳性；分化晚期CD5、CD23阳性，成熟为浆细胞后以上标记均阴性。利用单克隆抗体κ、λ（正常时κ：λ=2：1）可检测免疫球蛋白轻链的偏移，推断是否克隆性增殖免疫球蛋白。表12.6. 列出了外周B 淋巴系淋巴瘤的4种类型的免疫分型。
SLL(small cell lymphocyte lymphoma)--小细胞淋巴细胞淋巴瘤: 小细胞淋巴细胞淋巴瘤细胞一般表达CD19、CD20、CD43和CD79，CD5与以上抗原复合表达，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表达但表达较弱，CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。
MCL（mantle cell lymphoma）--斗篷细胞淋巴瘤：MCL包括以前分类为中等淋巴细胞淋巴瘤（ILL）、中度分化淋巴细胞淋巴瘤(IDL)、中心细胞淋巴瘤和套区细胞淋巴瘤（MZL）,占淋巴瘤的2%-8%，λ型较κ型常见， sIgM中度表达,IgD弱或阴性，表达CD19、CD20、CD22、CD43，但多数病例CD5阳性CD23阴性，CD10一般阴性，CD5阳性CD23阴性和Ig类型可帮助鉴别MCL和FCL。
FCL（Follicular center cell lymphoma）---泸泡中心细胞淋巴瘤：FCL占淋巴瘤的45%，表达CD19、CD20、CD22， sIg强表达,但多数病例CD10和CD23阳性，典型FCCL CD5、CD43和CD11c阴性。CD10阳性、CD11c阴性和sIg强表达利于与MZL鉴别。
MZL（Marginal zone lymphoma）--边缘带淋巴瘤和相关B 细胞淋巴瘤：典型免疫表型: CD19、CD20、CD22、HLA-DR阳性，sIg中度表达，CD5、CD10、CD23、CD25阴性，CD21、CD24多数情况下阴性，多数表达CD11c。CD5、CD10、CD23、CD25阴性，CD21、CD24多数情况下阴性，利于与CLL/SLL、FCCL、MZL鉴别。
2． T/NK细胞系淋巴瘤 早期T细胞一般CD2、CD5、CD7、cCD3阳性。T/NK细胞系淋巴瘤的详细分类及表型参见表12.8。细胞膜CD3阳性可确认为外周T细胞肿瘤, 外周T细胞肿瘤的特征是CD3与CD4或CD8复合表达，并常有克隆性T细胞受体，或α-β型或γ-δ型；
MF（mycosis fungoides）--蕈样真菌病和sezary综合症:占皮肤淋巴瘤的绝大多数，CD4阳性，同时表达CD2、CD3、CD5，有时CD7阴性，CD8阳性病例极少见但已有报道，有无TCRβ基因重排对鉴别淋巴瘤和炎性反应有帮助。
LCL（large cell lymphoma）--大细胞淋巴瘤: 大细胞淋巴瘤（LCL）占成人淋巴瘤的40%，儿童的1/3，成人80%是B细胞型的，儿童B细胞型和T细胞型各占一半。
3． 淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤 急性髓系细胞白血病（特别是M4、M5）淋巴结转移时有发生，如T、B淋巴细胞标记低表达应怀疑并按白血病免疫分型处理。
4． 造血细胞以外的肿瘤 检测淋巴结、胸腹水标本时如遇CD45阴性情况应考虑非造血系统肿瘤淋巴结、胸膜、腹膜转移。
十四. 流式细胞术在血液学中的应用 红细胞疾病诊断
（一）网织红细胞测定
计数外周血中网织红细胞数量,对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意义。有核红细胞在成熟过程中,脱去细胞核后仍有少量RNA残留在细胞浆内,再经过约一天时间残留RNA完全消失,成为成熟红细胞。这种细胞浆内有残留RNA的红细胞称作网织红细胞。正常情况下有一定量的网织红细胞出现在外周血中,正常值为1.0～1.5%,上限3.0%,但当红细胞数异常时会出现错误结果。因此用网织红细胞绝对值表示,正常值5～15×1010/L。由于常规方法测定须先在体外经活体染色(最常用亚甲兰),然后在显微镜下计数,计数细胞数有限。用流式细胞仪测定网织红细胞具有以下优点:①可避免由于细胞核的碎片或铁幼粒细胞的颗粒的存在而出现假性网织红细胞升高②可避免人为误差③因为可在短时间内测量上万个细胞,结果较常规方法准确、可靠,④同时可给出网织红细胞年龄结构。
流式细胞仪测定网织红细胞方法简单,只须将红细胞洗净后用荧光染料染色后即可上机检测。常用的荧光染料有焦宁Y(Pyronin Y) 丫啶橙(Acridine OrangeAO) 碘化丙啶(崐Propidium Iodine PI) 花青( Cyanine dye)等。
（二）PNH诊断
阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）因血细胞膜上锚固蛋白-糖磷酸肌醇（GPI）减少或缺乏而导致与GPI有关的补体激活抑制因子如CD55、CD59减少或缺乏，因而红细胞对补体异常敏感发生溶血。流式细胞仪检查CD55、CD59十分敏感，正常人CD55、CD59双阳性细胞>95%，PNH病人CD55、CD59明显减少，这种减少不仅表现在红细胞上，粒细胞、淋巴细胞也有减少。已发现CD55c可能对GPI减少或缺乏较CD59更敏感。
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