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液相色谱柱表面碳含量和极性对分离的影响

yigaozizi

2012/11/02
食品检测

私聊

液相色谱（LC）

色谱柱表面碳含量和极性对分离的影响

一背景

反相色谱柱如C18是色谱分析工作者在实验中经常使用的工具，但是不同种类的C18色谱柱往往表现不一样。

本研究的目的是从C18色谱柱的表面性质去揭示影响分离效果的因素。主要考虑的表面性质有碳含量和表面极性（硅羟基数）。

二实验原理

通过对阿巴斯甜标准品和酸奶样品中阿巴斯甜的测定，对比不同C18色谱柱的分离效果，结合各种色谱柱的表面性质，从而揭示出二者之间的关系。

右图为阿斯巴甜的结构：

三实验部分

3.1 样品处理

准确称取酸奶5g左右，加入10mL1%三氯乙酸，1mL2%乙酸铅，颠倒数次，6000r/min 离心15min，取上清液于25mL容量瓶，5mLPH=4.3水洗涤沉淀， 6000r/min 离心10min，提取上清液，用PH=4.3水定容。将样品用0.45μm滤膜过滤，将样品进液相检测。

3.2 液相条件

仪器：Agilent HPLC 1200
色谱柱见表1.

流动相：甲醇：水=69：31

流速：0.8mL/min

进样量：20μL

检测波长：208nm

柱类型	长度 /mm	粒径/μm	孔径/Å	%C	比表面㎡/g	封尾	封尾类型	PH
Venusil ASB C18	4.6*250	5	150	12%	200	否	-	0.8-7.5
Venusil XBP C18 (L)	4.6*250	5	150	15%	200	是	2次	1.5-9.0
Venusil AQ C18	4.6*250	5	100	18%	380	是	1次	1.5-9.0
Venusil XBP C18(2)	4.6*250	5	100	18%	380	是	1次	1.5-9.0

四实验结果

4.1 标液色谱图

图1及图2是用阿斯巴甜的标准品在四款C18色谱柱上得到的谱图。当我们将流动相得pH从4.3调整到3.0的时候，我们发现除了XBP C18(L)之外，其他色谱柱对阿斯巴甜的保留时间发生了前移。为什么会这样呢？原因是，C18色谱柱除了对阿斯巴甜有反相保留作用之外，还有解离羟基提供的弱离子交换作用。当流动相pH值降低的时候，羟基的解离被抑制，那么解离的羟基的数量减少，这样弱离子交换作用就被消弱了，导致阿斯巴甜的保留时间前移。而XBP C18(L)由于经过两次的封尾，解离的羟基几乎没有，它对阿斯巴甜的保留不依赖于弱离子交换作用，因此当流动相的pH变化的时候，阿斯巴甜在柱上的保留几乎不受影响。

4.2 酸奶样品色谱图

首先，需要知道几个数据，阿斯巴甜: pKa1= 3.3, pKa2=7.2；硅羟基:pKa= 5；蛋白质:pKa1=3-8?

当流动相pH值从4.3变化到3时，阿斯巴甜的解离状态变化不大，尤其是其氨基官能团在pH4.3时已经是充分解离了，变成pH3时，解离氨基的数量几乎没有变化。而硅羟基的pKa是5，当流动相pH变成3的时候，偏离其pKa两个单位，使得硅羟基的解离被抑制，提供弱离子交换的作用被抑制，而不解离羟基的数量增加，提供的氢键极性吸附作用增加。而牛奶中的蛋白质种类较多，但是大部分在酸性条件下，会由于羧基解离的减弱，其反相保留作用会增加，因而蛋白质在C18色谱柱上的保留会变强。

由3.1.1方法处理的酸奶样品进液相检测，也用4根液相柱，流动相PH值由4.3调到3，看看会有什么变化？

由图3可见，pH从4.3到3，阿斯巴甜在ASB C18上保留时间前移，而蛋白质保留增加，产生了时间上的重叠，导致蛋白质对阿斯巴甜的干扰。

由图4可见，同样，在AQ C18上也是如此。

由图5可见，XBP C18(2)也是这样，不过它由于经过一次三甲基一氯硅烷的封尾，和前两个C18色谱柱相比，情况略微好些。

由图6可见，XBP C18（L）由于阿斯巴甜几乎没有前移，它和蛋白质的分离度虽然减少，但是没有像前面三款色谱柱那样和蛋白质重叠在一起。

五结论

根据以上实验展示的规律，我们可以有以下结论：

（1）碳含量的影响：

阿巴斯甜的保留时间随着碳含量递增

（2）表面极性的影响：

阿巴斯甜和杂质(蛋白质等)分离随着表面极性的减弱越来越好。

（3）没有不好的色谱柱，只有不合适的色谱柱。（所以以后再碰到某根色谱柱不能满足你分离杂质和目标物的目的，第一个想法不应该是否定色谱柱的性能，而是应该想想这根色谱柱适不适合用于这个实验，毕竟要找根万能的色谱柱是比较困难的）

（4）根据样品和目标物去选择合适的色谱柱。

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私聊

yuduoling

第1楼2012/11/02

楼主不参加原创大赛吗

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私聊

yigaozizi

第2楼2012/11/02

参加呢！但是还没有通过审批呀~
yuduoling(yuduoling) 发表:楼主不参加原创大赛吗

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私聊

yigaozizi

第3楼2012/11/02

以上实验是在选择色谱柱过程中发现的有趣现象，我把它们的联系整理了一下。还请大家多多指教呀~

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私聊

jianhuilcn

第4楼2012/11/02

（1）碳含量的影响：

阿巴斯甜的保留时间随着碳含量递增

这个是从哪里看出来的呢？

LZ写得很好啊，学习了

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私聊

jianhuilcn

第5楼2012/11/02

请教一下LZ，pka和pH值的关系是怎样进行判断的。

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私聊

houjjun

第6楼2012/11/02

这个写的很好，可以得奖

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武灵

第7楼2012/11/02

经验分享，可以让大家少走弯路啊。
这色谱柱选择，是实验非常重要的一步。

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私聊

nphfm2009

第8楼2012/11/03

应助达人

的确是一篇不错的文章，多交我们如何选拔色谱柱

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私聊

haoyuee

第9楼2012/11/03

谢谢楼主分享这么好的文章。想请教下楼主，ASB C18在PH4.3时出现了双峰，他们的积分面积和PH3时相比如何。PH4.3时后面的较小峰是分裂还是杂质的影响，如果是分裂可否用楼主的弱离子交换作用来解释？

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私聊

yigaozizi

第10楼2012/11/05

为什么我不能用“回复本帖”？？
TO：jianhuilcn
1、阿斯巴甜保留时间与碳含量的关系，可以从3.2液相条件下的表格和图1或者图2看出来，从表格中可以查到不同型号色谱柱的碳含量。
2、PKa和PH的关系
需要解释一下，PKa：对于一个可生成离子的化合物，PKa是该化合物50%呈离子状态，50%呈中性状态的PH。
以弱酸HA的电离为例：
HA--H（+）+A（-）
[A-]/[HA]=10的(PH-PKa)次方
当PH-PKa=2时，HA基本是99%以上电离为离子态了

( ⊙ o ⊙ )啊！！！这么回复好麻烦啊~不知大家能不能看明白啊~~~

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