瓢虫
第1楼2006/06/01
2 蛋白质芯片在基础研究方面的应用
Thulasiraman et al,比较鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)的两种生理状态下的蛋白质全貌.鼠疫耶尔森菌有两个中间宿主中:一种为虱类,另一种为噬齿类.鼠疫耶尔森菌可以在两种温度下26 ℃和37 ℃表达不同的蛋白质,通过比较两种生理状态细胞溶解物,利用静态金属吸附捕获,强化阳离子交换芯片(SAX-2),鉴定出在37 ℃温度下存在而26 ℃生理状态下所没有的分子量为14.9 KDa和78.8 KDa的两个蛋白质.14.9 KDa的蛋白质被鉴定为抗原-4,78.8 Kda的蛋白质为Catalase/peroxidase KatY蛋白质[29] .
Collins et al [30] 在体外,用SELDI-TOF证实结核杆菌中上WhiB3编码蛋白和Rpor编码蛋白相互作用.他们将WhiB3(his)和带有369-528氨基酸片段的RpoV基因,在大肠杆菌中过表达纯化.然后,分别用疏水表面H4芯片和IMAC-3静态金属离子的芯片与其结合.由于WhiB带有组氨酸作用位点,因而可以与带Ni2+离子的IMAC-3强烈结合,而不与H4芯片结合.带有396-528氨基酸的GST-RporV则与H4芯片结合.通过反相色谱化结合对照组表明GST-RporV与IMAC-3结合不具有显著性意义.然后把WhiB3固定在IMAC芯片上,分别用纯化的GST-RpoV、GST和伴清蛋白与WhiB3(his)作用.在质谱图中发现有GST-RpoV,从而证实WhiB3与RpoV之间有相互作用.
Adilakshmi最近报道,用ProteinChipâarray系统,通过生物素标记的全长度的S25 mRNA作为芯片探针,来证实SELDI-TOF-MS鉴定出在肝瘤细胞处于氨基酸饥饿状态调节核糖体S25 mRNA的两种新蛋白质.在对照组中,则不见表达.已往的实验证实,肝瘤细胞处于饥饿状态时,则p53蛋白与S25 mRNA结合,在持续饥饿状态下,S25 mRNA则从核内运输到胞质中,从而诱导细胞调亡.鉴定出的两个蛋白质分别La(RNA-binding phosproprotein antigen,RNA结合磷蛋白抗原)43 537 Da和MTF-1(zinc finger metal response element-binding trarscription factor,锌指金属反应成分结合转录因子)72 830 Da.MTF-1还未见报道,其作用机制还需进一步研究[31,32] .
Amaar与其同事发现29 KDa的胰岛素样生长因子结合蛋白质-5(Insulin-like grow binding protein,IGFBP),是一个重要的骨成形调节因子,其本身也是一种不依赖胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)的生长因子.而IGFBP-5有一段核内定位序列,因而推测他可能可以进入核内,并与核蛋白结合从而影响骨成形基因的转录.用IGFBP-5作为诱饵蛋白通过酵母双杂交观测与U2人骨肉瘤cDNA文库反应.结果发现与FHL2有相互作用,FHL2含有4个半LIM结构域.把FHL2固定在蛋白质芯片上,加上IGFBP3-6四个蛋白和对照组作用一段时间后,用缓冲液洗去.通过SELDI-TOF-MS分析,发现只有IGFBP-5组中出现一个质量28 732.6+H的峰,而其他组则没有出现.证实IGFBP-5确实和FHL2作用从而调节骨的形成[33] .
3 蛋白质芯片在临床方面的应用
Christophe et al最近用含有铜离子的IMAC-3芯片鉴定出一个约16 570 Da的蛋白质.该蛋白质在胰腺癌患者的胰液中检出率为67 %,在其他类胰脏病中的检出率为17 %.用ProteinChip免疫鉴定该蛋白质是从急性胰腺炎和肝细胞癌患者的胰泡中释放出的一种称为HIP/PAP-I(hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis-associated-protein I)的蛋白质.HIP/PAP-I水平在胰腺癌患者的胰液和血清中含量与对照组相比,二者都具有极显著性意义.但是,胰腺癌患者胰液中的HIP/PAP-I水平比血清中的大1 000倍,与对照组相比,胰液中HIP/PAP-I的含量[患者组(143.75±235.52) mg/ml,对照组(6.04±7.59) mg/ml]远大于血清中的含量[患者组(99.96±140.66) ng/ml,对照组(35.25±28.44) ng/ml].由此,可以根据患者胰液中HIP/PAP-I的含量来帮助鉴定是否患上致死率很高的胰腺癌[34] .
Wright et al通过研究前列腺患者的组织提取液,寻找已知的前列腺特异抗原(PSA),前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphotase),前列腺特异膜抗原(PMSA)和前列腺特异肽.所使用的方法:从使用LCM(laser capture microdissection)方法获得的前列腺患者的细胞和体液中,发现了前列腺癌中上调两个分别为33 KDa和18 KDa的蛋白质[35-49] .尽管没有发现单一蛋白质来区别前列腺癌患者和对照组,但却发现一组蛋白质的峰值与健康老年男性群体不同.而有报道发现一个50.8 KDa的蛋白质存在于所检查的全部患者的血清和尿液中.这可能是50.8 KDa蛋白质是由33 KDa和18 KDa的两个亚基构成的蛋白质,或者是两个单独的蛋白质由于芯片上的探针同时捕获了这两个蛋白质,这还需要进一步研究证实[29,35] .
有人发现了在乳腺癌细胞中存在28.3 KDa特异蛋白质,由此设计出NMP66试剂盒,用其对可疑患者进行检测,结果在乳腺癌早期诊断中及晚期转移性乳腺癌的诊断上特异性达到100 %,在排除非恶性肿瘤个体的特异性达到96 %,远高于当前临床上目前应用的检测手段[50-52] .
瓢虫
第2楼2006/06/01
Brown把SELDI-TOF和LCM技术相结合在3种卵巢肿瘤组织中发现一组特异肽段[53,54] .Paweletz et al 利用LCM获得细胞群,希望得到既有疾病特异性而且有组织特异性的诊断指纹图谱.他们分别比较了四组患者的乳腺、卵巢、食管和前列腺中的癌变上皮细胞.每1例抽取1 500个细胞,用相同的芯片分析,结果在8例标本中均出现了同一质量的峰值,相同器官比较也都出现了相似的一系列峰值,证实了他们的猜想.这些峰与正常人的相应标本比较,可以对特定组织的特定部位是否癌变做出早期检测[54-57] .
Vlahou et al 用SELDI-TOF-MS蛋白质芯片分析一组患者的尿液中的蛋白质,发现肿瘤患者的尿液中有多种蛋白质的改变,其中包括5种异常的新蛋白和7种异常的蛋白组合,分子量从3.3-13.3 KDa不等,从而把检测早期膀胱癌的准确率提高78 %.以前的泌尿细胞学法检查准确率只有33 %[58,59] .
在艾滋病的研究中,尽管早就知道CD8 T细胞可以产生一种小分子蛋白,能在试管中抑制HIV感染,甚至可能在体内也有作用.但是这种抗病毒因子(CD8 antiviral factor,CAF)一直没有得到鉴定.美国Zhang et al应用SELDI发现了抗病毒因子CAF(CD8+ antiviral factor),证实了CAF 具有的强烈的抗HIV能力.他们的研究结果将在最近发表(个人交流).
应用蛋白质芯片技术对患者的组织和脑脊液进行检测,发现了一种含有39-43个氨基酸b-淀粉状肽段,目前是公认的人脑产生神经系统退行性改变的标志物,可导致基因突变毒害神经细胞.
4 蛋白质谱分析技术在肝病研究中的应用
我国是世界上的肝炎大国:1.3亿乙肝病毒携带者;2 300万慢性肝炎患者;每年死于肝炎约23万人;每年防治费逾500亿人民币.迄今,尚无彻底根治乙型肝炎的治疗方案,因此慢性病毒性肝炎及其引起的肝硬化、肝癌等一系列肝病极大危害我国人民健康.目前有关的研究显示乙型肝炎的发病和机体免疫应答功能以及宿主遗传基因的多态性特点有直接的关系.在乙型肝炎病毒感染和致病的过程中,病毒和人体基因表达蛋白质谱及其在发病过程中的变化仍然是一个新的领域,蛋白质谱分析技术为我们系统地开展肝病蛋白组学的研究建立了一个良好的技术平台.以前发现在肝癌中有一特异蛋白(甲胎蛋白)与肝癌有关,而哪些蛋白质的变化可以直接反映人体急性、慢性乙型肝炎(轻型、中型和重型)、肝硬化和肝癌等病情,是本领域中最为关键的问题.现在,我们可以利用这一平台,比较这些患者蛋白质谱的特点,特别是阐明在不同发病阶段中,相关蛋白质谱的变化规律,这样能够全面展示各个病情阶段的蛋白质变化的全貌[4].例如,我们可以设计不同芯片组,把正常人肝组织抽提物,与慢性肝炎患者(HBV、HCV ……阳性者等),特定急性自愈性肝炎患者、肝硬化以及肝癌患者的肝细胞抽提物,通过全面系统的进行SELDI-TOF-MS分析比较他们的蛋白质全貌,找出他们各自的单个或一组特异的生物标记,进一步分析他们的功能以及发现与之相关的新基因,对于了解疾病的进展和发病机制,非常有意义.此外,我们通过分析和监视相应蛋白质的变化、作用,能够及时掌握患者病程的特点和进展的趋势,这不仅有利于病情的诊断、而且对于患者的个体化治疗均具有重要价值.最终通过我们系统的研究,还可以发现药物作用的靶点,甚至直接依据蛋白质的特点设计新型药物 .
总之,蛋白质芯片系统是当前蛋白质组学研究中比较理想的技术平台.由于该技术完全不依赖蛋白质的构象,从而优于那些类似DNA阵列的多属于抗体、抗原作用的普通蛋白质芯片,因为他们需要设计与重组蛋白质结合的技术.蛋白质芯片系统在研究超微量的蛋白质、高通量筛选蛋白质和鉴定生物标记等方面更加特异、快速、自动化.一旦某种疾病的单个或者一组生物标记被鉴定出来,就可以直接用于临床检测[12,15].Ciphergen公司推出的基于SELDI-TOF-MS的蛋白质芯片是一种新的技术,正在不断发展,但其还有大量工作要做:(1)芯片表面物质的固定技术的发展还有很大的潜力.(2)对于质谱的分析,还需要设计新的算法和软件,以消除背景噪声(background noise),简化后期分析质谱中成千上万质峰的巨大工作量.(3)在蛋白质的序列、构象、提纯、特性无法给出描述,还需要和其他技术,如二维电泳、酵母双杂交、生物信息学等结合使用,才能给出蛋白质的生化特征.毫无疑问,这项技术在功能基因组时代将发挥巨大的作用 .
致谢 我室刘明旭副研究员刚从美国回国,提供了有关本领域中研究资料,并对论文的修改提出了许多宝贵意见;美国Ciphergen公司中国部负责人许洋博士惠赠部分文献,在此一并表示衷心感谢.