省部重点实验室
第1楼2013/12/03
3. 酶切
我的原则一向是:尽量避免PCR,能酶切的多酶切,实在没办法才去PCR。
这里强烈推荐NEB的内切酶,还记得在有一次用别家的酶切过夜,结果质粒都被切碎了(当然当时质粒浓度也不高),而用NEB的酶,切个七十二小时仍旧一切OK,尤其现在NEB还推出了HF的内切酶,没有星活性而且统一都用Buffer4,很好用,在国内我都用TAKARA的酶,基本上还可以。
注意要读说明书,选用什么buffer,多少度,用不用加BSA,这些都要仔细读。
酶切的起始量,PCR产物没甚么可说的,全都切上,如果是从质粒上切片段,要根据你片段大小,片段适中,比如说7 kb质粒,有2 KB是目的片段,这时切个3-4 ug就足够了,如果只有0.2 KB,那最好多切点,6 ug-7 ug 内切酶也没问题。
4. 连接
最常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用,但是注意Buffer里有ATP,反复冻融ATP失活得很快,这时有两种办法,一种是象我们chair实验室,每次连接都统统朝里面加1uL ATP;另一种是我们实验室的策略,拿到buffer就分装,10 uL/管,一次性使用,哪怕就用1uL,剩下的直接扔掉。
连接最重要的注意事项:
(1)载体总量;
(2)载体和插入片段比例;
(3)载体和插入片段质量。
我在回收之后都要测载体浓度,一般来说,载体浓度在20-100 ng/uL很好,太低的话碰撞几率低,太高的话又会产生很多非目的克隆,总量从50-100 ng就可以,太低失败几率很高,太高克隆太多,挑克隆会很麻烦,反应总体积也有讲究,体积太大载体和目的片段碰撞几率太低,而且对感受态细胞也是个挑战,通用10-15 uL,我试过25 uL没有问题,40 uL就不行了。
载体和插入片段比例一般是1:3,如果很难连接,比如说平端连接,要适当提高载体浓度,同时加大比例1:10,我试过一端平一端粘连接,4 kb片段,4KB载体,连接成功率相当高,10个克隆里8个都是阳性的,但是7 KB片段,5 KB载体的平端连接就连试两周都失败,最后换策略分两段先后克隆进去的,这也給了我很深教训,隔了一阵又做类似的实验,这回我干脆连试都没试,继续分成两段分别连进去的。
3片段连接同理,如果片段不太大,比方说小于3 K,3片段连接成功几率很高,但是如果你片段太大,就不行了,我试过4 K载体,4 K片段A,2 K片段B连接,失败四五次,最后还是绕路走了。
5. 转化
这个简单遵循基本的准则就行,话说实验室原来从sigma买感受态(competent cell),后来发现还是自己做的效率高,尤其在使用XL-10细菌的时比DH5a效率要高,需要的话我可以发protocol上来。要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素,实验室原来有个volunteer,做一次失败一次,我就奇怪了,后来才发现他用的居然是加了KANA的LB,直接晕过去了。还有就是氯化钙的问题。氯化钙吸水性很强,吸水后就完蛋了,我一般把它放在干燥罐里(反正我也不知道啥名字,就那种玻璃罐,干燥用的),大家要不放心,用之前可以把氯化钙放在烘箱里烤一烤。
6. 鉴定
普通实验做酶切鉴定,阳性率非常高,大多数情况下四个中起码有三个是正确的,很多时候都是百分百正确,这里推荐一种叫fast digest的酶,切个十几分钟跑胶就行了。
如果找不到合适的酶切位点或者有其他问题,比方说有段时间我做个非常新潮的实验,初始步骤的虽然是蓝白筛选,但是白斑也大部分都不对,没办法鉴定就用菌液PCR,最夸张的一次是五十个白斑里面居然就一个阳性的(没办法,该实验特点),这要提质粒可提不起。菌液PCR也有讲究,很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多,为甚么?因为你PCR引物选的都在载体上,注意,引物必须分别在载体和插入片段上才准,PCR方法鉴定是极其准确的,我做过数百次菌液PCR,只要PCR条件正确,PCR和酶切结果绝对百分之百对得上。PCR鉴定做起来也很简单,拿个2 mL tube,装0.5 mL 加入相应抗生素的LB,摇个三小时左后取1 uL做模板就行了,楼下有个实验室的POSTDOC特喜欢做直接的菌落PCR,我没试过,效果怎样不好说。
还要多说一句,要注意质粒是低拷贝还是高拷贝,普通的质粒一般4mL摇过夜,1.5 mL就能提到500 ng/uL 总体积40 uL的质粒(根据试剂盒不同,最高提过800 ng/uL,也试过200 ng/ul,都正常)。如果是低拷贝质粒,象PET系列和pshuttle系列,都是低拷贝,能拿到100 ng/uL就已经很好了,这时候需要4 ML菌当2 ML提,但是最要命的还是Adeasy 质粒(用来做腺病毒的),这个质粒超过30 KB,普通KIT回收效率低到忍无可忍,一定要用特定的试剂盒才行,还是那句话,这些都要读说明书。
7. 测序
我们拿到测序结果时候,不仅要核对具体的序列,而且要看测序图,这很重要,因为有时候光看结果对,实际上图显示的不对,或者虽然结果不对,但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信,出现突变也不怕,有很大可能性是简并密码子,还要重点检查的地方就是“接头”的地方,因为偶尔引物会出错,比方说少个碱基什么的,还有时候酶切之后连接也会丢一或者俩碱基什么的(这些问题我都碰到过),如果不仔细检查到了后期悔之无及。
还要注意反向测序引物,尤其用到SV40,因为我用PEGFP这套质粒用习惯了,等换成大概是TET-ON那套系统,SV40正好是反过来的,我也没留神,结果测回来的是载体……又吃了一次教训。