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高效液相法PITC柱前衍生检测蛋氨酸

液相色谱（LC）

  • 前处理：标准溶液 称取D-蛋氨酸标准品（阿拉丁，纯度99%）30mg于100ml容量瓶中，加入0.1mol/ml 盐酸溶液溶解并定容。取上述溶液5mL，置于25ml量瓶中，加入0.1mol/L PITC-乙腈溶液及1mol/mL三乙胺-乙腈溶液各2.5mL，混匀。取溶液10mL，加入正己烷15ml，放置20min，取下层溶液，微孔滤膜（0.45um）过滤，即得。

    空白溶液： 取0.1mol/ml 盐酸溶液5mL，置于25ml量瓶中，加入0.1mol/L PITC-乙腈溶液及1mol/mL三乙胺-乙腈溶液各2.5mL，混匀。取溶液10mL，加入正己烷15ml，放置20min，取下层溶液，微孔滤膜（0.45um）过滤，即得。

    仪器：岛津LC-15C,紫外检测器SPD-15C

    色谱条件：    色谱柱：PhenomenexSynergiC18柱(4.6 mm×250 mm,4μm)

    流动相：0.1mol/L乙酸钠溶液（乙酸调PH=6.5）+乙腈=80+20

    检测波长：254nm

    柱温：43°C

    流速：1.0ml/min

    进样量：20ul

    色谱图如下

    备注：黑色为空白溶液。

    红色为蛋氨酸标准溶液。



    问题：1、杂峰太多太大，有什么更好的除杂办法？

    2、D-蛋氨酸怎么是两个峰？

    3、大家有什么有更好的条件柱前衍生法测定蛋氨酸？（目前用柱前衍生测定蛋氨酸，可以后，测定多中氨基酸）

    备注：PITC-乙腈溶液放置了1个月，不知道有没问题。



    希望大家不吝赐教！感激不尽！


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  • a6712947

    第1楼2014/02/09

    自己重新配置 PITC-乙腈溶液，做出来D-蛋氨酸就是一个峰，看来是PITC-乙腈溶液放置时间过长变性导致变成两个峰了。

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  • zhaohua8011

    第2楼2014/02/10

    流动相还是不要配置太多，长时间放置！

    a6712947(a6712947) 发表:自己重新配置 PITC-乙腈溶液，做出来D-蛋氨酸就是一个峰，看来是PITC-乙腈溶液放置时间过长变性导致变成两个峰了。

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  • a6712947

    第3楼2014/02/11

    这个到是没有。

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  • 老多_小多

    第4楼2014/02/11

    图谱怎么看不到

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  • doczheng

    第5楼2014/02/12

    如果你想以后做多种氨基酸，建议你还是从梯度入手吧，18种氨基酸也是这样分出来的，还有一个建议,衍生化反应的时候，把体积缩小比例，衍生时控温和控时

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  • 有水有渝

    第6楼2014/02/12

    应助达人

    PITC衍生以前做过好像要加热衍生，楼主给的方法中衍生不需要时间吗？

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  • zjxhigh258

    第7楼2014/02/13

    楼主你好!
    我也用PITC柱前衍生测过色氨酸和络氨酸（其实这两种用210紫外即可，带环的），衍生方法基本与你相同，上样后也是一对杂峰。自己当时回想一下，可能0.45过滤有影响，会不会是混合液中的有机相把滤膜溶解了产生杂质？我当时用的是水系的针式滤膜，所以用有机系膜会不会消除影响？ 需验证。在文献上看PITC衍生是现在的主流方法呢，应该不会有问题。

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  • a6712947

    第8楼2014/02/16

    需要，是我没写清楚，衍生1h

    有水有渝(xky0230699) 发表:PITC衍生以前做过好像要加热衍生，楼主给的方法中衍生不需要时间吗？

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  • a6712947

    第9楼2014/02/16

    是按比例，缩小试剂的用量吗？

    我看到有一些资料上，氨基酸200ul，PITC100ul，正己烷400ul。

    这样做的，好处是什么？量小，衍生更彻底吗？

    doczheng(doczheng) 发表:如果你想以后做多种氨基酸，建议你还是从梯度入手吧，18种氨基酸也是这样分出来的，还有一个建议,衍生化反应的时候，把体积缩小比例，衍生时控温和控时

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  • a6712947

    第10楼2014/02/16

    我做实验的时候，过滤是用的有机膜

    zjxhigh258(zjxhigh258) 发表:楼主你好!

    我也用PITC柱前衍生测过色氨酸和络氨酸（其实这两种用210紫外即可，带环的），衍生方法基本与你相同，上样后也是一对杂峰。自己当时回想一下，可能0.45过滤有影响，会不会是混合液中的有机相把滤膜溶解了产生杂质？我当时用的是水系的针式滤膜，所以用有机系膜会不会消除影响？ 需验证。在文献上看PITC衍生是现在的主流方法呢，应该不会有问题。

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