高效液相色谱法分析苯并芘大鼠肝脏线粒体的代谢产物

feixiang168

2014/09/29

私聊

液相色谱（LC）

高效液相色谱法分析苯并芘大鼠肝脏线粒体的代谢产物

本实验建立了一种用高效液相色谱法分析苯并芘及其在大鼠肝脏线粒体中的六种代谢产物的分析方法。使用乙腈、水梯度洗脱作为流动相，紫外探测器分析得到苯并芘的羟基化代谢产物以及苯并芘酮，包括3-羟基苯并芘、9-羟基苯并芘、苯并芘4,5-二氢二醇、苯并芘-7,8-二氢二醇、9，10-二羟基-9，10-二氢苯并芘、苯并芘二酮。其中苯并芘二酮含量最低。该实验结果对于推断细胞CYP1A1酶在体内体外模型中对于苯并芘增毒和解毒作用奠定了重要的基础。

前言：苯并芘是苯与芘稠合而成的一类多环芳烃，苯并芘和其他多环芳烃主要是有机物的不完全燃烧或热解生成，并且在环境中普遍存在。除了污染空气的吸入，摄入的主要途径有吸烟和饮食以及一些职业的摄入如煤、焦炭、沥青的燃烧以及煤焦油的使用。苯并芘能够导致细胞毒性、致畸致突变的毒性以及致癌的毒性。

动物实验长期暴露于苯并芘中可导致动物的皮肤、胃、肺组织的癌变。苯并芘在作用于DNA之前需要代谢活化，这也是苯并芘发挥毒性很重要的代谢步骤。细胞色素P450（CYP）酶和环氧化物酶是主要的苯并芘的活化酶,首先CYP酶将苯并芘氧化为环氧化物然后在环氧化物水解酶的作用下生成二氢二醇，CYP同工酶将其进一步的活化为活性成分苯并芘-7,8 - 二氢二醇-9,10 - 环氧化物（BPDE），其可作用于DNA，其优先在鸟嘌呤残基上形成加合物，该加合物是BPDE在体内体外试验中于DNA主要的加合物。在CYP酶中，CYP1A1和B1认为是BaP代谢活化中重要的酶，但是CYP1A1在体内排毒的作用较大于其活化BaP的作用。为了解释这些发现，BaP的体内体外代谢与解毒作用应该进一步进行评价，定性和定量分析BaP在CYP同工酶和环氧化物酶下的所有代谢产物，以及这些致癌物与DNA加成物的评价也很有必要。本实验优选色谱条件使得BaP在大鼠肝脏线粒体内的代谢产物能够很好的分离以及通过紫外检测器灵敏的检测。

苯并芘在生物体内的代谢步骤：

材料和方法

试剂

甲醇（色谱级）乙腈（色谱级），苯并芘 ,NADP⁺,葡萄糖-6-磷酸，二喹啉甲酸，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

微粒体的制备

微粒体来自于10只SD大鼠的肝脏，预先用苏丹I处理。微粒体蛋白质浓度通过二辛可宁酸蛋白质测定法测定，牛血清蛋白作对照。CYP同工酶的含量通过示差光谱测定。

孵化体系：

用于研究BaP代谢的孵化体系包含有100mM磷酸钠缓冲液（pH7.4），NADPH生成体系（1毫NADP+，10mL D-葡萄糖-6 - 磷酸，1U/mL的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）,0.5mg的微粒体蛋白质，50μM的BaP（溶于5μl甲醇），总体积为500微升。通过加入50μl的NADPH生成体系来启动反应的发生。孵育体系通过未加入酶体系或无NADPH生成体系或无的BaP来控制。孵化在敞开的试管中进行（37℃），20分钟后，取5μl 1mM的非那西丁乙醇溶液加入作为内标物。BaP的代谢物用乙酸乙酯（2×1毫升）萃取两次，并蒸发至干。将样品溶解在25μl的甲醇，通过HPLC分离。

BaP代谢物的HPLC分析：

安捷伦液相1200高效液相色谱仪配紫外可见检测器，色谱柱为diamonsil 4.6﹡150﹡5u

色谱条件：

所用的色谱条件如下表：

时间
流动相A(乙腈)
流动相B（水）
流速
0
0%
100%
0.6ml/min
35
30%
70%
40
60%
40%
45
80%
20%
50
100%
0%

我们还对代谢产物进行了质谱验证；质谱：采用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱

10毫克/毫升的的α-氰基-4- 羟基肉桂酸50%乙腈溶液（0.3%乙酸）为MALDI基质。

将0.5ul溶解于乙腈中的样品与0.5ul基质溶液混合后，使其在室温下干燥。

附图：

图1.流动相：乙腈：水 85:15 时的BaP代谢物的HPLC

图1.优化后的流动相：乙腈：水梯度洗脱时的BaP代谢物的HPLC

结果与讨论：

本实验为得到由CYP-和环氧化物水解酶介导的BaP代谢产物，在实验中的应用了大鼠肝微粒体，由于CYP1A1 是BaP在体外代谢最有效的酶之一，对肝微粒体我们采用了CYP1A1诱导剂，以苏丹红I进行标记。本实验检测到了单和二羟基化的BaP代谢产物以及二酮的BaP，这些代谢物是通过CYP1A1与环氧化物水解酶来实现的。

为了改善现有分析BaP的代谢产物的HPLC色谱法，使紫外检测器检测更加灵敏，我们还对检测波长进行了考察，还对洗脱系统和色谱程序进行考察，最终确定了254nm的检测波长及现有的四步程序法。

已有文献中使用甲醇/水或乙腈/水作为流动相，以高效液相色谱法测定BaP的代谢产物，本实验初期综合考察了这两种流动相，并调整比例，最终确定了合适的洗脱条件是的代谢产物能够有效分离。

总结：本试验开发了一种分析BaP代谢物的新方法，该方法实现了高分离度，高灵敏度且方法简便的目的

分
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时间	流动相A(乙腈)	流动相B（水）	流速
0	0%	100%	0.6ml/min
35	30%	70%
40	60%	40%
45	80%	20%
50	100%	0%