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霉菌酵母计数的实验室操作规程

愿有岁月可回首

2017/07/04

私聊

食品毒素/微生物检测

1. 目的

对《食品安全国家标准食品生生物学检验霉菌和酵母计数》GB4789.15-2016进行细化，指导微生物实验室霉菌和酵母计数检测具体操作。
2. 适用范围
本操作规程适用于食品、化妆品及一次性筷子中霉菌和酵母菌的计数。
3. 设备及材料
冰箱、霉菌培养箱、拍击式均质、显微镜、电子天平、高压灭菌器及其他灭菌和常规检测用器皿、材料。
4. 培养基及试剂
生理盐水（0.85%氯化钠溶液）
孟加拉红培养基或马铃薯葡萄粮琼脂
5. 检验程序


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6. 操作步骤
6.1 1:10样品匀液制
以生理盐水做样品稀释液。
6.1.1食品样品
样品适宜时，取25g/ml样品加入装有225ml稀释液的均质袋中，用拍击式均质器充分混匀；如果样品硬度较大，不宜使用拍击式均质器时，取25g样品加入装有225ml稀释液的椎形瓶中充分振摇，制成1:10样品匀液。
6.1.2 化妆品样品
油性液体，取10g/ml样品，先加入5ml灭菌石腊混匀，再加10 ml灭菌吐温80，42℃水浴，加75ml灭菌生理盐水，拍击均质1min，制成1：10样品匀液；
水溶性液体、膏、霜、粉剂等，称10 g样品加90ml灭菌生理盐水，拍击均质1min，制成1：10样品匀液;
疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10 g/ml样品加10 ml灭菌液体腊和10 ml灭菌吐温80，再加入70 ml灭菌生理盐水，拍击均质3 min，制成1：10样品匀液。
6.1.3 一次性筷子样品
取一次性筷子25g（通常取6双，表面积约为50平方厘米）加入装有225ml稀释液的无菌袋中充分振摇，作为1:10的样品匀液。
6.2 样品匀液稀释
用移液枪取1ml 1:10的样品匀液注入装有9ml稀释液的试管中，另换一个枪头，反复吹吸，制成1:100样品匀液。按此法依次制备10倍递增稀释的系列样品匀液。
根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入2个无菌平皿内。同进分别取1ml样品稀释液加入2个平皿作空白对照。

6.3 倾注平皿

将冷却至46℃的孟加拉红培养基倾注平皿，及时转动平皿使培养基和样品匀液混合均匀。
注意：孟加拉红培养基可置46±1℃的水浴箱中保温，但不应超过4小时。凝固后的培养基只可复溶一次，否则将影响培养基质量。

6.4 培养

待琼脂凝固后，将平皿倒置，于28±1℃霉菌培养，3天后观观察，5天记录结果。

6.5 计数

肉眼观察，选取菌落数在10-150CFU的平板计数。根据检测要求，计数霉菌和酵母的总和或分别计数霉菌数和酵母数。霉菌、酵母和细菌的菌落鉴别可参照以下方法。

6.5.1肉眼观察菌落特征

通常情况下肉眼观察，霉菌、酵母、细菌三种菌落在孟加拉红培基上的特征如下：

霉菌菌落	绒毛状、棉絮状、蛛网状。具有菌丝体，菌落较大，扁平，较干燥。颜色多样，白色、黑色、黄色多见，菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致，菌落周围有晕圈。
酵母菌菌落	菌落较细菌大且厚，质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色均一。光滑、湿润、常带黏性，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。培养时间较长时可呈皱缩状，表面较干燥。位于琼脂内的菌落，可呈铁饼形、三角形及多角形。
细菌菌落	由于受到抑制，通常会很小，红色，常呈橄榄形。

6.5.2 低倍镜观察菌落边缘形态
肉眼观察菌落形态无法区别孟加拉红培养基上酵母和细菌时，可用低倍普通光学显微镜观察平板表面菌落边缘较薄较透光的部分，在边缘能看到细胞的是酵母，看不见的则是细菌。

霉菌菌落	边缘可见明显的菌丝体。
酵母菌菌落	边缘较规整，调节聚焦螺旋可见到细腻如细沙的结构。若无法确认可用接种针从边缘稍稍刮开菌落，即可在镜下见到卵圆形的细胞。
细菌菌落	菌落紧密，边缘整齐，不易透光，看不到细沙粒样的结构。

6.5.3 染色法观察
挑取菌落用亚甲基蓝或革兰氏染色，酵母菌霉菌在低倍镜下即可见到细胞或菌丝，而细菌不可见，无菌丝的酵母体积较大，在40倍显微镜下清晰可见，细菌则需在油镜下才能清楚观察。
7. 结果记录与报告
7.1 结果记录
计算两个平板菌落的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数计算。
7.1.1 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他夹板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
7.1.2 若所有平板上菌落数均小于10CFU，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.1.3 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。
7.2 报告
7.2.1 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。
7.2.2 菌落数大于或等于100时，可将前3位数字采用“四舍五入”原则修约，取前两位数字，后面用0补齐位数表示结果（例如：结果为1210可表示为1200）；也可采用两位有效数字乘以10的指数形式来表示（例如：结果为1210可表示为1.2*10³）。
7.2.3 称重取样以CFU/g为单位，体积取样以CFU/ml为单位。
7.2.4 根据检测要求分别报告霉菌和酵母数，或报告霉菌和酵母总数。
8. 参考文件
《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》 GB 4789.15-2016
《一次性筷子第1部分木筷》 GB19790-2005
《化妆品微生物标准检验方法》 GB 7918-1987