利用ADME柱快速分析头孢类药物LC-MS/MS方法摸索
前言：由于ADME色谱柱具有其他类型色谱柱所不具备的特殊表面极性和疏水性，因此最适用于常规C18色谱柱（ODS）无法实现的强极性化合物与疏水性化合物同时保留的情况。当使用C18色谱柱分析保留弱、无法取得分离的时候，使用ADME色谱柱，在原色谱条件下也能改善分离效果。因此，ADME是分析时的第二选择色谱柱。
头孢克肟（Cefixime）是一种重要的头孢菌素类抗生素，属于可口服的第三代头孢菌素类抗生素，临床上应用于敏感菌引起的肺炎、支气管炎、泌尿道感染、淋病、胆囊炎、胆管炎、猩红热、中耳炎、副鼻窦炎等。
由于头孢克肟极性极强，我们选择资生堂生产的一款键合金刚烷基团的高表面极性色谱柱CAPCELL PAK ADME进行分析。图1为金刚烷基ADME填料表面示意图。C18色谱柱在反相色谱中应用最广泛，适用于分析很多化合物，但是在反相模式下很难对强极性化合物进行分析。而且随着药物代谢产物分析技术的发展，在以药代动力学为代表的多个相关领域中，对于含有多种成分的强极性代谢产物与强疏水性代谢前体进行共同分析的需求也越来越多。对此，资生堂开发了导入与迄今为止的常规C18基团结构完全不同的金刚烷基填料。这种填料的官能团结构虽然与常规C18色谱柱的烷基不同，但仍然是烷基，因此完全可以作为反相色谱柱来使用。（引自大曹色谱微信公众号）
图1 金刚烷基ADME填料表面示意图（引自大曹色谱微信公众号）
在常规液相色谱分析中，反相C18（ODS）色谱柱可满足绝大多数化合物的分析。但是大家应该也遇到过强极性物质保留弱/不保留的情况。这种情况下，一般的思路是：
★调整流动相
★尝试其他种类反相柱（C8、C4、CN、C1等）
★在100%水相流动相条件下，使用高极性色谱柱进行分析
★改变分离模式——从反相模式到HILIC模式
上面的方法对于极性化合物的分析也许有效，但如果是强极性化合物和疏水性化合物共同分析，怎么办？
可以考虑选择ADME色谱柱。因为金刚烷基填料具有以下特长：
1.CAPCELL PAK ADME色谱柱键合立体笼状结构官能团——金刚烷基团，因此具有与常规C18色谱柱完全不同的表面特性，在极性较强化合物的分析中有独特的优势，兼具疏水选择性和笼状结构的立体选择性，能够对一些具有微小差异的化合物进行有效分离，在药物代谢分析中也表现出明显的优势。
2. 键合立体笼状结构官能团——金刚烷基团，同时采用聚合物包被技术进行表面处理。
3. 兼具高表面极性和一定疏水性，适用于高极性物质和疏水性物质的共同分析。（引自大曹色谱微信公众号）
选择好色谱柱后，我们挑选了性质想近的几个内标化合物，分别为头孢他美、阿莫西林、氟氯西林钠等，其pka见图2-5。使用CAPCELL PAK ADME色谱柱在0.1%甲酸水/乙腈体系下对混合对照品和血浆样品进行分析，如图6和图7所示。头孢克肟峰形良好，保留时间为1.66 min。在混合对照品中，阿莫西林在该检测离子下显示为两个峰，头孢他美保留时间1.71，峰形正常，可考虑选做内标物。血浆样品能够正常检测目标物质峰。
图2 头孢克肟pka及其在不同PH值下存在的形态（由化学结构信息网Chemicalize查询得到）
图3 头孢他美pka及其在不同PH值下存在的形态（由化学结构信息网Chemicalize查询得到）
图4 阿莫西林pka及其在不同PH值下存在的形态（由化学结构信息网Chemicalize查询得到）
图5 氟氯西林钠pka及其在不同PH值下存在的形态（由化学结构信息网Chemicalize查询得到）
图6 混合对照品LC-MS分析图（由化学结构信息网Chemicalize查询得到）
图7 血浆样品LC-MS分析图（由化学结构信息网Chemicalize查询得到）
质谱结果：由于 TBKW 的结构中既含有碱性氮原子, 也含有羧基, 所以本实验比较了正、负两种离子检测。结果发现, TBKW 的甲醇-水 (50∶50) 溶液 (在正离子模式下响应约为负离子的10倍, 故优先选择ESI 源下正离子检测方式。在正离子检测模式下，TBKW 及内标 TBTM 分别主要生成 m/z 454.2 和m/z 389.2 的 +峰, 选择性对 +峰进行产物离子扫描分析, TBKW 生成的主要碎片离子分别为m/z 285.1 ,m/z126.1和m/z210.1, TBTM 生成的主要碎片离子有m/z 241.1。但实验过程中发现, m/z126.1和m/z210.1 的碎片离子响应弱, 且噪音高, 故最终选择m/z 285.1 和m/z 241.1 分别作为TBKW 及内标 TBTM 定量分析时的产物离子。待测物及内标的+产物离子全扫描质谱图及相应出峰时间见图8-11。
图8 头孢克肟Q1 质谱图
图9 头孢他美Q1质谱图
图10 头孢克肟质谱色谱峰
图11 头孢他美质谱色谱峰
我们对导入金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME色谱柱对于极性化合物的保留行为进行了考察，可以看出CAPCELL PAK ADME色谱柱对强极性化合物的保留作用良好。CAPCELL PAK ADME色谱柱可以对常规C18色谱柱所无法保留的强极性化合物进行良好保留，并且因其能在反相模式下使用，故可作为改善C18色谱柱分离效果的“第二选择”色谱柱。
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