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【分享】色谱方法分类----基础知识

chris

2007/03/13

前处理综合讨论

色谱法的基本原理
利用样品混合物中各组分理、化性质的差异，各组分程度不同的分配到互不相溶的两相中。当两相相对运动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离。
两相中，固定不动的一相称固定相；移动的一相称流动相。
分类：
根据流动相分—以气体作流动相—气相色谱——固定相为液体气-液色谱
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　固定相为固体气-固色谱
　　　　　　—以液体作流动相—液相色谱——固定相为液体液-液色谱
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　固定相为固体液-固色谱
　　　　　　—当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时——超临界色谱

根据固定相的附着方式
　　　　　　—固定相装在圆柱管中—柱色谱
　　　　　　—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄膜色谱（平板色谱）
　　　　　　—液体固定相涂在纸上—纸色谱（平板色谱）

根据分离机理
　　　　　　—分配色谱—样品组分的分配系数不同
　　　　　　—吸附色谱— 样品组分对固定相表面吸附力不同
　　　　　　—体积排阻色谱—利用固定相孔径不同，把样品组分按分子大小分开
　　　　　　—离子交换色谱—不同离子与固定相商相反电荷间的作用力大小不同

根据极性
　　　　　　—流动相极性＞固定相极性-反相色谱
　　　　　　—流动相极性＜固定相极性-正相色谱

　　气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。所以，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。
　　
一、吸附色谱（adsorption chromatography）
又叫液固色谱法：流动相是液体，固定相是固体。

分离原理：固定相是固体吸附剂，吸附剂是多孔性微粒物质表面有吸附中心。样品组分与流动相竞争吸附中心。各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留时间不同和实现分离。

固定相：固定相通常是强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。活性硅胶最常用。

流动相：弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
应用：对于极性，结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。

二、分配色谱
原理：固定液机械的吸附在惰性载体上，样品分子依据他们在流动相和固定相间的溶解度不同，分别进入两相分配而实现分离。
固定相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上。如全多孔微粒硅胶吸附剂。
根据极性不同分类：正相分配色谱—固定相载体上涂布的是极性固定液；
　　　　　　　　　　　　　　　　流动相是非极性溶剂；
　　　　　　　　　　　　　　　　可分立极性较强的水溶性样品；
　　　　　　　　　　　　　　　　弱极性组分先洗脱出来。

　　　　　　　　　反相分配色谱—固定相载体上涂布的是非极性或弱极性固定液；
　　　　　　　　　　　　　　　　流动相是极性溶剂；
　　　　　　　　　　　　　　　　强极性组分先洗脱出来。
　　液-液分配色谱固定相中的固定液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，且不能进行梯度洗脱，已经不大为人们所采用。

三、键合相色谱
　　考虑分配色谱法中固定液的缺点，因此将各种不同的有机关能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。
键合固定相优点：○ 对极性有机溶剂有良好的化学稳定性
　　　　　　　　○使色谱柱的柱效高、寿命长
　　　　　　　　　　○实验重现性好
　　　　　　　　　　○几乎适于各种类相的有机化合物的分离，尤其是k’宽范围的样品
　　　　　　　　○可以梯度洗脱
根据极性不同分类：正相键合相色谱—固定相极性＞流动相极性
　　　　　　　　　　　　　　　　　固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。
　　　　　　　　　　　　　　　　　适于分离脂荣、水溶性的极性、强极性化合物

　　　　　　　　　反相键合相色谱—固定相极性＜流动相极性
　　　　　　　　　　　　　　　　　固定相：烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS柱或C18柱就　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　是最典型的代表，其极性很小。
　　　　　　　　　　　　　　　　　适于分离非机性、弱极性离子型样品，
　　　　　　　　　　　　　　　　　是当今液相色谱的最主要分离模式。
正相HPLC（normal phase HPLC）：
　　是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。

反相HPLC（reversed phase HPLC）：
　　由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流动相是甲醇和乙腈。

四、体积排阻色谱（SEC，size exclusion chromatograghy）
（又称凝胶色谱和分子筛色谱）
原理：以多孔凝胶（如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酰胺等）作固定相，依据样品分子量大小达到分离目　　　　的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞，　　　　在柱中被强滞留，后被洗脱。

根据样品性质分类：凝胶过滤（GFC）—用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核　　　　　　　　　　　　　　　　　　苷酸、多糖。
　　　　　　　　　凝胶渗透（GPC）—用于分析脂溶性样品，如测定高聚物的分子量。

　　SEC主要依据分子量大小进行分离，因此与样品、流动相间的相互作用无关。因此不采用改变流动相的组成来改善分离度。

五、离子交换色谱
（ion exchange chromatography, IEC）
分离原理：使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离；带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。

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