蛋白表达纯化

• 各位大神们，本人小白一枚，最近在把重组的大肠杆菌破壁离心，取上清过柱子，纯化酶，但是酶活非常低甚至没有了，正在找问题，请各位大神指教啊，（1）用来破壁的液体，一般要用pbs缓冲液嘛，ph多少的，pbs里面要加氯化钠嘛，一般ph是多少？（2）我上的镍柱，结合液是20mmol/L的pbs.ph值为7.4的，里面还加了0.5mlo/L的氯化钠，5mmol/L的咪唑。洗脱液是20mmol/L的pbs.ph值为7.4的，里面加了0.5mlo/L的氯化钠，500mmol/L的咪唑，我这个有没有问题呀。（3）我当时透析用的水，透析了30小时吧，用的转子，里面加的冰，换了4次水，是不是应该也要用缓冲液透析呢，用pbs嘛，那这里面不需要加盐吧。（5）我们这个酶用来降解的物质会跟pbs还有盐酸反应，我也担心测酶活时会受缓冲液影响。请各位大神指教啊