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细胞培养及形态学观察

  • 小矮马
    2021/10/10
    小矮马
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分离/萃取

  • 细胞培养及形态学观察



    1 细胞复苏:从液氮中取出细胞后,将细胞冻存管用细胞复苏盒迅速转移至37恒温水浴锅中,轻摇使细胞迅速解冻。细胞解冻后立即吸取至10 mL预热的完全培养基中,吹打混匀,900 rpm 离心8min吸弃上清,用5 mL完全培养基重悬细胞,将细胞接种至25 cm2培养瓶中,沿培养瓶瓶底吹打,使细胞附着在培养瓶瓶底,恒温375% CO2条件下培养。

    2细胞传代:H446为半贴壁半悬浮细胞,DMS114为贴壁细胞,H69H526为悬浮细胞。吸弃培养基后用5 mL 1×PBS清洗2次,吸弃上清,每25 cm2培养瓶或6 cm培养皿加入1 mL胰酶消化2 min。镜下观察细胞变圆形或轻拍开始脱落,加入2 mL完全培养基终止消化(悬浮细胞不需胰酶消化),移入15 mL离心管内,900 rpm,离心8 min吸弃上清液,加入新鲜培养基重悬细胞并吹打混匀。将细胞按实验需求接种于培养瓶或培养皿中,培养条件同上。

    3)细胞计数:制备细胞悬液(实验步骤同细胞传代),吹打混匀,取200 μL的细胞悬液至1.5 mL EP管内,再加入200 μL台盼蓝染色剂,充分吹打混匀细胞悬液。取适量细胞悬液滴加于细胞计数板上,在显微镜下观察并计数(被台盼蓝染成蓝色的细胞为死细胞,死细胞不计数),分别计数视野中计数板上四个大格子中细胞的数量,并计算平均值。细胞密度=平均值×104,即每毫升培养基中细胞的数量。

    4 细胞冻存:将处于对数生长期的细胞制备成细胞悬液(步骤同上)并计数。每0.8-1.0×106个细胞加入1 mL细胞冻存液,轻轻吹打混匀,每支冻存管加1 mL的细胞悬液(标记清楚冻存细胞代数,所用培养基,细胞来源,冻存日期,冻存者姓名缩写)。将冻存管用封口胶封好后放入细胞冻存盒(含异丙醇)中,放入-80冰箱保存,第二天将细胞移至液氮罐中以长期保存。

    细胞形态学观察

    1)铺板 对数生长期 H446H69H526DMS114细胞,计数,分别接种等量细胞至6孔板,十字形晃动,使细胞分布均匀,继续培养。

    2)药物处理 待细胞融合率约80%加入不同浓度(0IC20IC50)含药培养基。每组均设置DMSO对照组。

    3)放入培养箱培养4872 h后观察细胞形态并拍照。
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