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五灵胶囊HPLC指纹图谱研究

  • SH104301
    2021/10/14
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液相色谱(LC)

  • 五灵胶囊由原第四军医大学西京医院研制,清华德人西安幸福制药有限公司独家生产。五灵胶囊由柴胡、灵芝、丹参、五味子4味药材制成。功能主治为疏肝健脾活血用于慢性乙型肝炎肝郁脾虚挟瘀证,症见纳呆,腹胀嗳气、胁肋胀痛、疲乏无力等 。本方中柴胡辛行苦泄、善条达肝气、疏肝解郁、理气止痛为君药;灵芝味甘性平,益气健脾、补中益脾,丹参活血化瘀、通经止痛,共为臣药;五味子酸甘性温、补气养阴、佐助灵芝益气补中、安定心神、防柴胡疏泄升散而耗气伤阴为佐药。现代医学研究证明五灵胶囊对脂肪肝,肝纤维化有特殊疗效。

    与化学制剂相比,传统中医的整体观决定了需要对中药中多种成分进行综合评价,但中药及其制剂中化学成分的多样性、复杂性以及相互间的协同作用,导致用单一成分或几个成分很难准确、全面地表达中药的质量和疗效。指纹图谱技术是近年逐渐发展起来的一项质量控制技术,它具有信息量大,特征性强,能整体控制多种组分的特点[14-15]。本实验参照2020年版《中国药典》(一部)及相关文献[16-19],建立了以柴胡、丹参、五味子中化学成分为主要指标的HPLC指纹图谱方法,通过对共有峰进行归属及确认来控制五灵胶囊的质量。


    1. 材料

    1.1仪器


    Agilent1260 infinityII型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);AG285型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);

    1.2试剂与试药

    对照品:丹酚酸B(批号111562-201917,纯度96.6%),丹参酮IIA(批号110766-202022,纯度98.9%),柴胡皂苷a(批号110777-201912,纯度94.8%),五味子醇甲(批号110857-201815,纯度99.7%),五味子乙素(批号110765-201813,纯度99.1%)五味子甲素(批号110764-201915,纯度99.5%)均购于中国食品药品检定研究院;五灵胶囊(清华德人西安幸福制药有限公司);色谱乙腈(美国Fisher公司);磷酸(色谱纯)天津市大茂化学试剂厂;甲醇(分析纯)天津市科密欧化学试剂有限公司;水为娃哈哈纯净水。

    2.方法与结果

    2.1色谱条件


    色谱柱ChromCore C18250 mm × 4.6 mm5 μm);

    流动相;乙腈(A- 0.1%磷酸(B);

    梯度洗脱(0-15 min80%-50%B15-40 min50%-30%B40-60 min30%-0%B60-80 min0%-0%B;80-85 min, 0%-80% B;85-90 min, 80%-80% B;

    体积流量0.8 mL/ min

    检测波长:UV210 nm

    柱温30

    进样量10 μL

    2.2溶液制备

    2.2.1 混合对照品溶液配制


    取丹酚酸B、丹参酮IIA、柴胡皂苷a、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素对照品适量,精密称定,置容量瓶中,加甲醇制成每1 mL分别含丹酚酸B 100 μg、丹参酮IIA 20 μg、柴胡皂苷a 400 μg、五味子醇甲300 μg、五味子甲素500 μg、五味子乙素500 μg的混合对照品溶液,用0.22 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。


    2.2.2 供试品溶液制备


    取五灵胶囊内容物0.4 g,精密称定,置于50 mL容量瓶中,加入甲醇约40 mL,超声(频率50 Hz,功率200 W30 min,至室温后再加甲醇至刻度,摇匀,用0.22 μm滤膜滤过,取续滤液,即得。10批五灵胶囊为清华德人西安幸福制药有限公司生产,批号见表1

    1 样品信息

    编号 批号编号 批号
    S1 200101S6 200303
    S2 200102S7 200304
    S3 200103S8 200501
    S4 200301S9 200502
    S5 200302S10 200503

    2.2.3 阴性样品溶液

    参照五灵胶囊制法,分别制备缺柴胡、灵芝、丹参、五味子药材的阴性样品,按2.2.2项下方法制备阴性样品溶液,即得。

    2.3方法学考察

    2.3.1 精密度考察


    用批号为200503样品,2.2.2项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下连续进样6针,以五味子醇甲为参照峰,测得各共有峰相对峰面积RSD<3%,相对保留时间RSD<1%,表明仪器精密度良好。

    2.3.2 稳定性考察

    用批号为200503样品,2.2.2项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下于02481224h进样,以五味子醇甲为参照峰,测得各共有峰相对峰面积RSD<5%,相对保留时间RSD<2%,表明供试品溶液24h内稳定性良好。

    2.3.3 重复性试验

    用批号为200503样品,2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样,以五味子醇甲为参照峰,测得各共有峰相对峰面积RSD<5%,相对保留时间RSD<2%,表明该方法重现性良好。



    2.4指纹图谱建立

    2.4.1 共有峰标定


    选取五味子醇甲峰为参照峰(S),色谱图中各色谱峰保留时间与参照峰(S)保留时间的比值为相对保留时间,通过相对保留时间值标定共有峰,其中16个峰为10批样品共有,标定为共有峰,共有峰面积占总峰面积75%以上,结果见图1

    2.4.2 相似度评价

    共有峰通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)分析,中位数法建立对照指纹图谱R,见图210批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别为0.9980.9990.9980.9980.9970.9950.9990.9820.9970.986,均在0.980以上。

    2 相似度分析结果

    编号 相似度编号 相似度
    S1 0.998S6 0.995
    S2 0.999S7 0.999
    S3 0.998S8 0.982
    S4 0.998S9 0.997
    S5 0.997S10 0.996



    1 10五灵胶囊样品HPLC指纹图谱



    2 对照指纹图谱

    2.4.3 专属性考察


    4种阴性样品及批号为200503样品,2.2.2项下方法制备成溶液,分别吸取4种阴性样品及样品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样,色谱图见图3。通过与阴性样对比可以得出,共有峰1111316归属丹参,共有峰2归属柴胡,共有峰345678910121415归属五味子。


    S1:丹参阴性样 S2:五味子阴性样 S3:灵芝阴性样 S4:柴胡阴性样 S5:五灵胶囊

    3 共有峰归属



    2.4.4 共有峰指认


    分别用混合对照品溶液及样品溶液按“2.1”项色谱条件下进样,色谱图见图4通过对照品峰对共有峰进行指认,1号峰为丹酚酸B2号峰为柴胡皂苷a3号峰为五味子醇甲,12号峰为五味子甲素,13号峰为丹参酮IIA15号峰为五味子乙素。




    A对照品




    B样品

    1.丹酚酸B 2.柴胡皂苷a 3.五味子醇甲

    12.五味子甲素 13.丹参酮IIA 15五味子乙素

    4 对照品及样品HPLC图谱


    3.讨论

    本实验用甲醇、乙腈分别对样品进行处理,结果发现甲醇处理样品后基线更稳定,峰数量较多,因此本实验采用甲醇处理样品。本实验采用回流提取法及超声提取法分别对样品进行处理,对比发现,两种处理方法差异不大,因此选用简单实用的超声提取作为提取方法。本实验对超声提取时间(10 min20 min30 min40 min)进行了考察,结果发现30 min时峰面积最大,30 min后峰面积几乎无变化,因此选择30 min为样品提取时间。本实验用乙腈-水,乙腈-0.1%磷酸,乙腈-0.25%磷酸分别做梯度考察,结果发现用乙腈-0.1%磷酸进行梯度洗脱,基线平稳,各峰分离度较好,因此采用乙腈-0.1%磷酸作为梯度洗脱流动相。本实验对样品溶液进行不同波长(210 nm250 nm270 nm305 nm)检测,发现210 nm时峰数量最多,信息量最大,因此采用210 nm作为检测波长。本研究还对流速及柱温等进行了考察,最后选择最佳流速为0.8 mL/ min;最佳柱温为30

    本方法的16个共有峰分别归属于柴胡、丹参、五味子3种药材中,较全面反映五灵胶囊中各种成分的分布和比例关系。灵芝主要成分为多糖、三萜及甾醇类化合物,三萜及甾醇类化合物种类复杂且含量较低,紫外光(200 nm-400 nm)范围内吸收很弱[20-21],故本图谱未能体现五灵胶囊中灵芝的成分分布及比例关系,这些不足有待于今后采用别的方法对灵芝继续进行研究。本方法通过对五灵胶囊中柴胡、丹参、五味子3种药材中多种成分的对比与分析相比直接测定制剂中几种化学成分的含量,具有操作简便,信息量大的优点,能较全面的控制五灵胶囊的质量。

    公司名称:清华德人西安幸福制药有限公司
    个人信息:苏××老师
    色谱柱信息:
    纳谱分析ChromCore C18 5μm, 4.6mm×250mm, 序列号:21538-001731

    +关注 私聊
  • zyl3367898

    第1楼2021/11/13

    应助达人

    检测过程完整,内容丰富,数据齐全,结论也很详细。

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