五灵胶囊由原第四军医大学西京医院研制，清华德人西安幸福制药有限公司独家生产。五灵胶囊由柴胡、灵芝、丹参、五味子4味药材制成。功能主治为疏肝健脾活血。用于慢性乙型肝炎肝郁脾虚挟瘀证，症见纳呆，腹胀嗳气、胁肋胀痛、疲乏无力等 。本方中柴胡辛行苦泄、善条达肝气、疏肝解郁、理气止痛为君药；灵芝味甘性平，益气健脾、补中益脾，丹参活血化瘀、通经止痛，共为臣药；五味子酸甘性温、补气养阴、佐助灵芝益气补中、安定心神、防柴胡疏泄升散而耗气伤阴为佐药。现代医学研究证明五灵胶囊对脂肪肝，肝纤维化有特殊疗效。
与化学制剂相比，传统中医的整体观决定了需要对中药中多种成分进行综合评价，但中药及其制剂中化学成分的多样性、复杂性以及相互间的协同作用，导致用单一成分或几个成分很难准确、全面地表达中药的质量和疗效。指纹图谱技术是近年逐渐发展起来的一项质量控制技术，它具有信息量大，特征性强，能整体控制多种组分的特点[14-15]。本实验参照2020年版《中国药典》（一部）及相关文献[16-19]，建立了以柴胡、丹参、五味子中化学成分为主要指标的HPLC指纹图谱方法，通过对共有峰进行归属及确认来控制五灵胶囊的质量。
1. 材料
1.1仪器
Agilent1260 infinityII型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AG285型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
1.2试剂与试药
对照品：丹酚酸B（批号111562-201917，纯度96.6%），丹参酮IIA（批号110766-202022，纯度98.9%），柴胡皂苷a（批号110777-201912，纯度94.8%），五味子醇甲（批号110857-201815，纯度99.7%），五味子乙素（批号110765-201813，纯度99.1%）五味子甲素（批号110764-201915，纯度99.5%）均购于中国食品药品检定研究院；五灵胶囊（清华德人西安幸福制药有限公司）；色谱乙腈（美国Fisher公司）；磷酸（色谱纯）天津市大茂化学试剂厂；甲醇（分析纯）天津市科密欧化学试剂有限公司；水为娃哈哈纯净水。
2.方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱ChromCore C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；
流动相；乙腈（A）- 0.1%磷酸（B）；
梯度洗脱（0-15 min，80%-50%B；15-40 min，50%-30%B；40-60 min，30%-0%B；60-80 min，0%-0%B;80-85 min, 0%-80% B;85-90 min, 80%-80% B）;
体积流量0.8 mL/ min；
检测波长：UV210 nm；
柱温30 ℃；
进样量10 μL。
2.2溶液制备
2.2.1 混合对照品溶液配制
取丹酚酸B、丹参酮IIA、柴胡皂苷a、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇制成每1 mL分别含丹酚酸B 100 μg、丹参酮IIA 20 μg、柴胡皂苷a 400 μg、五味子醇甲300 μg、五味子甲素500 μg、五味子乙素500 μg的混合对照品溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2.2 供试品溶液制备
取五灵胶囊内容物0.4 g,精密称定，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇约40 mL，超声（频率50 Hz,功率200 W）30 min，至室温后再加甲醇至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。10批五灵胶囊为清华德人西安幸福制药有限公司生产，批号见表1
表1 样品信息
| 编号 批号 | 编号 批号 |
| S1 200101 | S6 200303 |
| S2 200102 | S7 200304 |
| S3 200103 | S8 200501 |
| S4 200301 | S9 200502 |
| S5 200302 | S10 200503 |
2.2.3 阴性样品溶液
参照五灵胶囊制法，分别制备缺柴胡、灵芝、丹参、五味子药材的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液，即得。
2.3方法学考察
2.3.1 精密度考察
用批号为200503样品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6针，以五味子醇甲为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD<3%，相对保留时间RSD<1%，表明仪器精密度良好。
2.3.2 稳定性考察
用批号为200503样品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下于0、2、4、8、12、24h进样，以五味子醇甲为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD<5%，相对保留时间RSD<2%，表明供试品溶液24h内稳定性良好。
2.3.3 重复性试验
用批号为200503样品,按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，以五味子醇甲为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD<5%，相对保留时间RSD<2%，表明该方法重现性良好。
2.4指纹图谱建立
2.4.1 共有峰标定
选取五味子醇甲峰为参照峰（S），色谱图中各色谱峰保留时间与参照峰（S）保留时间的比值为相对保留时间，通过相对保留时间值标定共有峰，其中16个峰为10批样品共有，标定为共有峰，共有峰面积占总峰面积75%以上，结果见图1。
2.4.2 相似度评价
共有峰通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）分析，中位数法建立对照指纹图谱R，见图2。10批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别为0.998、0.999、0.998、0.998、0.997、0.995、0.999、0.982、0.997、0.986，均在0.980以上。
表2 相似度分析结果
| 编号 相似度 | 编号 相似度 |
| S1 0.998 | S6 0.995 |
| S2 0.999 | S7 0.999 |
| S3 0.998 | S8 0.982 |
| S4 0.998 | S9 0.997 |
| S5 0.997 | S10 0.996 |
图1 10批五灵胶囊样品HPLC指纹图谱
图2 对照指纹图谱
2.4.3 专属性考察
取4种阴性样品及批号为200503样品,按“2.2.2”项下方法制备成溶液，分别吸取4种阴性样品及样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，色谱图见图3。通过与阴性样对比可以得出，共有峰1、11、13、16归属丹参，共有峰2归属柴胡，共有峰3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15归属五味子。
S1:丹参阴性样 S2：五味子阴性样 S3：灵芝阴性样 S4：柴胡阴性样 S5：五灵胶囊
图3 共有峰归属
2.4.4 共有峰指认
分别用混合对照品溶液及样品溶液按“2.1”项色谱条件下进样，色谱图见图4，通过对照品峰对共有峰进行指认，1号峰为丹酚酸B，2号峰为柴胡皂苷a，3号峰为五味子醇甲，12号峰为五味子甲素，13号峰为丹参酮IIA，15号峰为五味子乙素。
A对照品
B样品
1.丹酚酸B 2.柴胡皂苷a 3.五味子醇甲
12.五味子甲素 13.丹参酮IIA 15五味子乙素
图4 对照品及样品HPLC图谱
3.讨论
本实验用甲醇、乙腈分别对样品进行处理，结果发现甲醇处理样品后基线更稳定，峰数量较多，因此本实验采用甲醇处理样品。本实验采用回流提取法及超声提取法分别对样品进行处理，对比发现，两种处理方法差异不大，因此选用简单实用的超声提取作为提取方法。本实验对超声提取时间（10 min、20 min、30 min、40 min）进行了考察，结果发现30 min时峰面积最大，30 min后峰面积几乎无变化，因此选择30 min为样品提取时间。本实验用乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.25%磷酸分别做梯度考察，结果发现用乙腈-0.1%磷酸进行梯度洗脱，基线平稳，各峰分离度较好，因此采用乙腈-0.1%磷酸作为梯度洗脱流动相。本实验对样品溶液进行不同波长（210 nm、250 nm、270 nm、305 nm）检测，发现210 nm时峰数量最多，信息量最大，因此采用210 nm作为检测波长。本研究还对流速及柱温等进行了考察，最后选择最佳流速为0.8 mL/ min；最佳柱温为30 ℃。
本方法的16个共有峰分别归属于柴胡、丹参、五味子3种药材中，较全面反映五灵胶囊中各种成分的分布和比例关系。灵芝主要成分为多糖、三萜及甾醇类化合物，三萜及甾醇类化合物种类复杂且含量较低，紫外光(200 nm-400 nm)范围内吸收很弱[20-21]，故本图谱未能体现五灵胶囊中灵芝的成分分布及比例关系，这些不足有待于今后采用别的方法对灵芝继续进行研究。本方法通过对五灵胶囊中柴胡、丹参、五味子3种药材中多种成分的对比与分析，相比直接测定制剂中几种化学成分的含量，具有操作简便，信息量大的优点，能较全面的控制五灵胶囊的质量。
公司名称：清华德人西安幸福制药有限公司
个人信息：苏××老师
色谱柱信息：
纳谱分析ChromCore C18 5μm, 4.6mm×250mm, 序列号：21538-001731
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