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液相色谱-质谱/质谱法测定猪肉中四环素类兽药残留量

  • SH104301
    2021/10/14
    仪信通会员战队
  • 私聊

液相色谱(LC)

  • 实验目的(实验背景及目的)

    选取空白猪肉样品作为基质按不同添加水平进行试验,比对纳谱、B净化柱、A净化柱三种SPE小柱回收状况的准确度与精密度,为后续实验室HLB净化小柱的选择提供参考依据。



    实验方法(前处理,标准品配置,色谱条件等):

    1.SPE小柱


    A净化柱

    纳谱

    B净化柱

    货号

    /

    HLB060-030060-1

    /

    描述

    HLB Pro

    SelectCore HLB

    Cleanert PEP-2 SPE

    规格

    60mg/3ml

    60mg/3ml

    60mg/3ml



    2. 试剂与材料

    除非另有说明,所有试剂均为优级纯,水为二级水。

    2.1 甲醇:色谱纯。

    2.2 乙酸乙酯:色谱纯。

    2.3 甲酸:色谱纯。

    2.4 柠檬酸溶液(0.1 mol/L:准确称取21.02 g柠檬酸,用水溶解,定容至1 L

    2.5 磷酸氢二钠溶液(0.2 mol/L:准确称取28.41 g磷酸氢二钠,用水溶解,定容至1 L,混匀后备用。

    2.6 Mellvaine 缓冲液:将1000 ml 柠檬酸溶液(0.1 mol/L)与625 ml磷酸氢二钠溶液(0.2 mol/L)混合,用氢氧化钠或盐酸调节PH=4.0±0.05

    2.7 Na2EDTA-Mellvaine 缓冲液(0.1 mol/L):称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H20)放入1625 ml Mellvaine 缓冲液中,使其溶解,摇匀备用。

    2.8 甲醇+水(1+19):量取5 ml甲醇与95 ml水混合。

    2.9 甲醇+乙酸乙酯(1+9):量取10 ml甲醇与90 ml乙酸乙酯混合。

    2.10 甲酸水溶液(0.1%):量取1 ml甲酸与1000 ml水混合。

    2.11 标准物质:

    物质

    国家标准物质编号

    浓度

    标准物质来源

    四环素

    GSB05-3334-2016

    100 μg/ml

    农业部环境保护科研检测所

    土霉素

    GSB05-3333-2016

    100 μg/ml

    农业部环境保护科研检测所

    金霉素

    GSB05-3332-2016

    100 μg/ml

    农业部环境保护科研检测所

    强力霉素

    GSB05-3335-2016

    100 μg/ml

    农业部环境保护科研检测所



    2.12 标准溶液

    2.12.1 标准储备溶液:准确移取四环素、土霉素、金霉素、强力霉素各1ml,分别用甲醇定容至10 ml,储备液浓度分别为10 μg/ml,储备液在-18下贮存于棕色瓶中,可稳定3个月。

    2.12.2混合标准工作溶液:移取四种10 μg/ml的储备液各100 μL,用0.1%甲酸水定容至1 ml,配置成1 μg/ml的混合标准工作溶液;再依次配置成20 μg/L50 μg/L100 μg/L200 μg/L400 μg/L系列的混合标准工作溶液,混合标准工作溶液使用前配制。

    3.样品前处理

    称取均质试验5 g(精确到0.01 g),置于50 ml聚丙烯离心管中,分别用约20 ml20 ml 0.1 mol/L EDTA-Mellvaine缓冲溶液冰水浴超声提取两次,每次涡混1 min,超声提取10 min4000 r/min离心5 min(温度低于15),合并上清液,并定容至50 ml,混匀,5000 r/min离心10 min(温度低于15),用快速滤纸过滤,取10 ml滤液待净化。

    4.净化与仪器条件

    目标化合物

    四环素/土霉素/金霉素/强力霉素

    样品基质

    猪肉

    样品基质中主要干扰物及其他成分

    油脂和蛋白

    分析方法

    (参考标准)

    GB/T 21317 动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法

    液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法

    具体操作步骤

    溶剂

    体积mL

    流速

    备注

    活化

    甲醇

    5

    自然流速

    /

    平衡

    5

    自然流速

    /

    上样

    样液

    10

    自然流速

    /

    淋洗1

    5

    自然流速

    /

    淋洗2

    甲醇+水(19+1

    5

    自然流速

    /

    洗脱

    甲醇+乙酸乙酯(1+9

    10

    自然流速

    /

    之后

    洗脱液40下,氮气吹至近干

    其它

    淋洗2完毕后,2.0 KPa以下减压抽干5 min

    检测仪器

    LC-MS/MS:赛默飞 TSQ Fortis

    色谱条件

    色谱柱

    纳谱分析,ChromCore C18 2.1*100mm,3.0μm

    柱温

    30

    流动相及梯度

    A:0.1%甲酸水 B:甲醇

    时间(min

    A%

    B%

    1.0

    80

    20

    4.8

    5

    95

    5.7

    5

    95

    6.0

    80

    20

    进样量

    5 μL

    流速

    0.35 ml/min

    质谱条件

    喷雾电压

    3500 V(+)

    鞘气压力

    30 Arb

    辅助气压力

    4 Arb

    蒸发温度

    300

    离子传输管温度

    350



    实验过程照片

    图一:提取液待净化




    图二:SPE小柱待活化




    图三:SPE小柱洗脱



    图四:0.1%甲酸水定容




    图五:过膜


    图六:上机分析




    实验谱图

    4种物质标准曲线图

    Compound

    RT

    备注

    四环素

    2.98



    同等浓度加标对比图中;
    黑色---B净化柱;
    蓝色---纳谱;
    红色---A净化柱

    土霉素

    3.08

    金霉素

    2.72

    强力霉素

    4.17



    空白基质TIC


    试剂空白TIC




    50 μg/kg-a




    50 μg/kg-b





    100 μg/kg-a




    100 μg/kg-b



    200 μg/kg-a



    200 μg/kg-b






    实验数据


    SPE类型

    化合物名称

    加标浓度

    平均回收率(%))

    精密度(%

    纳谱

    四环素

    50 μg/kg

    123

    2.4

    100 μg/kg

    116

    4.6

    200 μg/kg

    118

    1.8

    土霉素

    50 μg/kg

    119

    1.1

    100 μg/kg

    115

    6.3

    200 μg/kg

    118

    3.8

    金霉素

    50 μg/kg

    98.8

    4.6

    100 μg/kg

    98.0

    5.6

    200 μg/kg

    92.4

    2.2

    强力霉素

    50 μg/kg

    88.7

    3.8

    100 μg/kg

    80.2

    4.5

    200 μg/kg

    104

    0.46

    B净化柱

    四环素

    50 μg/kg

    80.2

    8.2

    100 μg/kg

    85.6

    10

    200 μg/kg

    86.4

    5.2

    土霉素

    50 μg/kg

    76.3

    9.5

    100 μg/kg

    84.3

    8.9

    200 μg/kg

    98.6

    8.6

    金霉素

    50 μg/kg

    70.2

    10

    100 μg/kg

    81.3

    7.8

    200 μg/kg

    74.6

    7.9

    强力霉素

    50 μg/kg

    72.7

    1.2

    100 μg/kg

    80.6

    4.1

    200 μg/kg

    82.3

    2.6

    A净化柱

    四环素

    50 μg/kg

    117

    5.6

    100 μg/kg

    97.2

    5.8

    200 μg/kg

    114

    3.6

    土霉素

    50 μg/kg

    113

    6.8

    100 μg/kg

    103

    5.2

    200 μg/kg

    114

    4.7

    金霉素

    50 μg/kg

    96.9

    6.5

    100 μg/kg

    94.5

    6.3

    200 μg/kg

    88.4

    4.6

    强力霉素

    50 μg/kg

    88.8

    4.2

    100 μg/kg

    82.5

    1.2

    200 μg/kg

    103

    2.3





    结果分析

    SPE小柱流速对比:纳谱>B净化柱>A净化柱。

    纳谱回收率:80.2%-123%,平均值106%;精密度0.46%-6.3%,平均值3.4%

    B净化柱回收率:70.2%-98.6%,平均值81.1%;精密度1.2%-10%,平均值7%

    A净化柱回收率:82.5%-117%,平均值101%;精密度1.2%-6.8%,平均值4.7%



    讨论

    实验选取猪肉作为样品基质,四环素、土霉素、金霉素与强力霉素作为目标化合物,以常用国标GB/T 21317为实验依据,分别添加检出限浓度、限值浓度、二倍限值浓度进行平行实验分析,通过实验数据可知:

    B净化小柱整体回收偏低;对于四环素与土霉素两种化合物而言,纳谱与A净化柱回收整体偏高(大于100%),而金霉素与强力霉素两种化合物回收较好,整体回收率而言,纳谱略好于A净化柱。

    就实验数据精密度而言,纳谱与A净化柱均小于5%


    结论

    实验发现纳谱小柱回收率与精密度均很优秀,且小柱净化过程中的流速较快,节省时间。

    最后,本文谨代表个人试验过程及体会,对于试验过程中的问题与不当之处,欢迎指出。



    公司名称:山东华一检测有限公司

    个人信息:郑××老师

    地址:山东省高新区高新二路生物医药加速器4楼山东华一检测有限公司

    色谱柱信息:

    纳谱分析ChromCore C18 3μm, 2.1×100mm,序列号:21313-001034

    纳谱分析SelectCore HLB 60mg/3ml



    +关注 私聊
  • zyl3367898

    第1楼2021/11/13

    应助达人

    检测过程完整,图谱与前处理图片清晰。

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