仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
当前位置:仪器社区 > 液相色谱

5009.121脱氢乙酸检测求助

液相色谱

  • 第一次做液相,目前在做脱氢乙酸方法验证,仪器条件都是按照国标5009.121设置,但峰形很差,请问是柱子的原因吗?柱子用的250mm*4.6mm的C18柱。
    +关注 私聊
  • mingxiaoyan

    第1楼2021/11/17

    这个影响因素很多,需要分析
    柱子,溶剂,流动相,基体干扰等都会造成这个情况

1
    +关注 私聊
  • dahua1981

    第2楼2021/11/17

    应助达人

    可以参考这个验证方法:

    方法验证



    为验证国标方法中C18小柱的保留效果,小编先使用脱氢乙酸标准溶液进行方法验证,确保现有实验条件下,目标化合物使用该方法能被有效回收,才能用来进行样品处理。

    参考的国标方法如下:






    实际操作中,小编做了两个处理:

    1、净化处理将脱氢乙酸标液按12.1.1步骤净化,收集洗脱液过滤上机。

    2、未净化处理:等浓度标液作对照直接上机检测。

    来看一下经过净化和未经过净化的样液脱氢乙酸的回收结果:

    (注:蓝色峰为脱氢乙酸标准溶液,黑色峰为洗脱液)



    不难看出,收集到的洗脱液吸收峰变形严重。

    考虑到两者基质溶剂不同,需要考察溶剂对峰形的影响。

    因此小编又取一定量的标准品储备液,分别用水、70%甲醇溶液配制成浓度为1ppm的上样溶液,上机测定结果,谱图如下:



    (其中蓝色峰为纯水基质,黑色峰为70%甲醇基质)



    由图可知,直接使用洗脱液上机会存在溶剂效应,需要将洗脱液中的甲醇除去,因此小编在洗脱步骤之后增加氮吹过程去除甲醇。

    令小编沮丧的是,除去甲醇后,回收率仍然不理想(15.35%)。小编收集了上样、淋洗步骤的流出液上机检测,发现目标物未被检出。结合上述实验结果看,导致目标物回收率低的情况可能出现在提取环节或固相萃取洗脱环节,目标物可能仍保留在小柱上。

    然而,整个操作过程实在太繁琐、太不确定!再去追究哪一步出现问题要花大量时间!

    综合整个操作流程,涉及两个调pH步骤,引入的误差无法准确控制;样品提取液较少的时,繁琐的操作难免导致目标物损失。一方面,检测结果准确度不好保障,另一方面,繁琐的流程限制了做样速度,增加方法改良的时间成本。这样的方法即便有效也难实现大批量样品的快速处理。

    那么换个思路进行方法优化如何?




    方法优化



    小编想,既然原有操作复杂、回收效果也不理想,那么能否通过更换更合适的SPE小柱,实现对方法的整体优化,达到准确,高效的实验效果?

    小柱的选型要由目标物性质决定,小编首先看了一下脱氢乙酸的化学性质:




    脱氢乙酸是吡喃的衍生物,常温下呈晶体状。脱氢乙酸晶体难溶于水,在甲醇中溶解度5%(w/w,25℃),水溶液弱酸性,饱和溶液pH=4。其盐类脱氢乙酸钠在水中溶解度较大。




    脱氢乙酸



    脱氢乙酸钠



    这里小编发现,脱氢乙酸是一种有机弱酸,其离子化状态是弱阴离子。那么,如果能使脱氢乙酸在提取和固相萃取富集环节保持离子化状态,是否可以利用离子交换机制选择小柱呢?

    考虑至此,小编选定了月旭P-SAX小柱(强阴离子交换柱)作为SPE净化柱。使用P-SAX小柱回收脱氢乙酸时,需要注意两个环节:

    碱性环境中上样(脱氢乙酸离子化,被小柱吸附);

    酸性环境中洗脱(脱氢乙酸变回中性分子,失去与小柱间的作用力,被洗脱)。




    优化后



    在进行了进一步优化后,最终的实验步骤、谱图、回收率如下(以洋葱基质为例):

    1、提取:

    称取2g样品于50mL离心管,加入5mL氢氧化钠溶液(1mol/L),定容至25mL,涡旋混匀2min,超声提取15min,8000r/min离心5min,上清液待净化。

    2、净化

    SPE柱:月旭Welchrom® P-SAX,规格:200 mg/6mL。

    活化:5mL甲醇,5mL水,弃去

    上样:10ml待净化液上样,弃去

    淋洗:5mL水,弃去,抽干

    洗脱:5mL10%甲酸甲醇,收集于15ml离心管中,抽干

    浓缩:40℃氮吹至约200μL,用水定容至2ml,过0.45μm水系滤膜后上HPLC检测。

    3、仪器条件

    色谱柱:月旭Ultimate®XB-C18, 4.6×250mm, 5μm

    流动相:0.02mol/L乙酸铵(pH=10):甲醇=35:65

    柱温:35℃

    进样量:20μL

    检测波长:484nm

    流速:1.0mL/min











    改进后的提取步骤避免了国标方法中两次调节pH的繁琐,操作快速、回收率更加理想。

    小编后来又用黄油、辣条、面包、青团等样品做了验证,回收率和RSD均十分理想。

    方法改良成功!(鼓掌~~~~)




    总结:

    在进行脱氢乙酸的检测中,按方法开发步骤分别进行了洗脱液、SPE小柱类型、前处理方法优化。因此在某种目标物检测方法改进时,需要针对目标物性质、SPE机制、实验整体流程三个方面进行,且每一个步骤都需要摸索出最jia条件,从而得出一个稳定、高效的检测方法。

0
    +关注 私聊
  • Ins_562ebccc

    第3楼2021/11/17

    看起来峰没有分开?是混合物吗

0
    +关注 私聊
  • 瓦说

    第4楼2021/11/17

    不是,只有脱氢乙酸

    Ins_562ebccc(Ins_562ebccc) 发表:看起来峰没有分开?是混合物吗

0
    +关注 私聊
  • 瓦说

    第5楼2021/11/17

    好的,我试试

    dahua1981(dahua1981) 发表:可以参考这个验证方法:方法验证为验证国标方法中C18小柱的保留效果,小编先使用脱氢乙酸标准溶液进行方法验证,确保现有实验条件下,目标化合物使用该方法能被有效回收,才能用来进行样品处理。参考的国标方法如下:实际操作中,小编做了两个处理:1、净化处理:将脱氢乙酸标液按12.1.1步骤净化,收集洗脱液过滤上机。2、未净化处理:等浓度标液作对照直接上机检测。来看一下经过净化和未经过净化的样液脱氢乙酸的回收结果:(注:蓝色峰为脱氢乙酸标准溶液,黑色峰为洗脱液)不难看出,收集到的洗脱液吸收峰变形严重。考虑到两者基质溶剂不同,需要考察溶剂对峰形的影响。因此小编又取一定量的标准品储备液,分别用水、70%甲醇溶液配制成浓度为1ppm的上样溶液,上机测定结果,谱图如下:(其中蓝色峰为纯水基质,黑色峰为70%甲醇基质)由图可知,直接使用洗脱液上机会存在溶剂效应,需要将洗脱液中的甲醇除去,因此小编在洗脱步骤之后增加氮吹过程去除甲醇。令小编沮丧的是,除去甲醇后,回收率仍然不理想(15.35%)。小编收集了上样、淋洗步骤的流出液上机检测,发现目标物未被检出。结合上述实验结果看,导致目标物回收率低的情况可能出现在提取环节或固相萃取洗脱环节,目标物可能仍保留在小柱上。然而,整个操作过程实在太繁琐、太不确定!再去追究哪一步出现问题要花大量时间!综合整个操作流程,涉及两个调pH步骤,引入的误差无法准确控制;样品提取液较少的时,繁琐的操作难免导致目标物损失。一方面,检测结果准确度不好保障,另一方面,繁琐的流程限制了做样速度,增加方法改良的时间成本。这样的方法即便有效也难实现大批量样品的快速处理。那么换个思路进行方法优化如何?方法优化小编想,既然原有操作复杂、回收效果也不理想,那么能否通过更换更合适的SPE小柱,实现对方法的整体优化,达到准确,高效的实验效果?小柱的选型要由目标物性质决定,小编首先看了一下脱氢乙酸的化学性质:脱氢乙酸是吡喃的衍生物,常温下呈晶体状。脱氢乙酸晶体难溶于水,在甲醇中溶解度5%(w/w,25℃),水溶液弱酸性,饱和溶液pH=4。其盐类脱氢乙酸钠在水中溶解度较大。脱氢乙酸 脱氢乙酸钠这里小编发现,脱氢乙酸是一种有机弱酸,其离子化状态是弱阴离子。那么,如果能使脱氢乙酸在提取和固相萃取富集环节保持离子化状态,是否可以利用离子交换机制选择小柱呢?考虑至此,小编选定了月旭P-SAX小柱(强阴离子交换柱)作为SPE净化柱。使用P-SAX小柱回收脱氢乙酸时,需要注意两个环节:碱性环境中上样(脱氢乙酸离子化,被小柱吸附);酸性环境中洗脱(脱氢乙酸变回中性分子,失去与小柱间的作用力,被洗脱)。优化后在进行了进一步优化后,最终的实验步骤、谱图、回收率如下(以洋葱基质为例):1、提取:称取2g样品于50mL离心管,加入5mL氢氧化钠溶液(1mol/L),定容至25mL,涡旋混匀2min,超声提取15min,8000r/min离心5min,上清液待净化。2、净化SPE柱:月旭Welchrom® P-SAX,规格:200 mg/6mL。活化:5mL甲醇,5mL水,弃去上样:10ml待净化液上样,弃去淋洗:5mL水,弃去,抽干洗脱:5mL10%甲酸甲醇,收集于15ml离心管中,抽干浓缩:40℃氮吹至约200μL,用水定容至2ml,过0.45μm水系滤膜后上HPLC检测。3、仪器条件色谱柱:月旭Ultimate®XB-C18, 4.6×250mm, 5μm流动相:0.02mol/L乙酸铵(pH=10):甲醇=35:65柱温:35℃进样量:20μL检测波长:484nm流速:1.0mL/min改进后的提取步骤避免了国标方法中两次调节pH的繁琐,操作快速、回收率更加理想。小编后来又用黄油、辣条、面包、青团等样品做了验证,回收率和RSD均十分理想。方法改良成功!(鼓掌~~~~)总结:在进行脱氢乙酸的检测中,按方法开发步骤分别进行了洗脱液、SPE小柱类型、前处理方法优化。因此在某种目标物检测方法改进时,需要针对目标物性质、SPE机制、实验整体流程三个方面进行,且每一个步骤都需要摸索出最jia条件,从而得出一个稳定、高效的检测方法。

0
    +关注 私聊
  • 歌名

    第6楼2021/11/17

    应助达人

    你这个是标液的图片还是样品跑的图片?标液的话不要应该这样,我之前做这个脱氢乙酸用岛津2030按国标设置基本没问题,峰型比你这个好太多了,看看你的管路链接和色谱柱是不是柱效不行了;如果是样品的图片,还有可能是样品基质没处理干净,基质效应引起目标物峰型变差,考虑净化好样品在上机分析吧

0
    +关注 私聊
  • 瓦说

    第7楼2021/11/18

    我这个是进的标液,应该是柱子的问题

    歌名(Ins_eedcdc41) 发表:你这个是标液的图片还是样品跑的图片?标液的话不要应该这样,我之前做这个脱氢乙酸用岛津2030按国标设置基本没问题,峰型比你这个好太多了,看看你的管路链接和色谱柱是不是柱效不行了;如果是样品的图片,还有可能是样品基质没处理干净,基质效应引起目标物峰型变差,考虑净化好样品在上机分析吧

0
    +关注 私聊
  • smart123

    第8楼2021/11/18

    做脱氢乙酸时,要调流动相的ph,再微调一下分峰时间,就行了。

0
    +关注 私聊
  • 瓦说

    第9楼2021/11/18

    请问分峰时间怎么调啊?

    smart123(smart123) 发表:做脱氢乙酸时,要调流动相的ph,再微调一下分峰时间,就行了。

0
相关仪器 相关专场 相关厂商 相关耗材
举报帖子

执行举报

点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...