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RNA的分离提取与含量测定

  • 锦锦添花
    2021/11/30
    实验猫
  • 私聊

生命科学仪器综合讨论

  • 一、酵母RNA的分离提取:

    1、在1.5gNaOH溶于150mL水中加入15g酵母,配制成10%的酵母悬液;

    2、室温搅拌30min,用6mol/LHCI中和至pH=7.0

    3、转至水浴锅上加热,90oC,10 min,移下并进行冰水浴,使温度迅速降至10oC.

    4、放置冰柜中2h,上清与沉淀分离,沉淀离心(3000rpm15min),合并两次上清;

    5、上清用6mol/LHCL,调至pH=2.5,加入等体积的乙醇使RNA沉淀,置于冰箱中过夜,沉淀即为RNA粗制品,上清中含有多糖;

    6、将4沉淀部分用少许水转至烧杯中,调体积至150ml,超声波处理10min(破壁),90oC加热,15min,以使细胞内容物充分释放。

    7、离心(3000rpm10min),所得沉淀调体积至100mL,超声波处理10min90oC 加热,15min,合并两次上清,80oC水浴,浓缩至100mL左右,醇析(加2倍体积醇)得RNA粗制品,常温放置。

    二、酵母核糖核酸的组成鉴定

    200mg提取的核酸,加入1.5mol/L硫酸溶液10mL,在沸水浴中加热10分钟,制成水解溶液并进行组分的鉴定。

    1、嘌呤碱取水解液1mL加入过量浓氨水,然后加入1mL 0.1mol/L硝酸银溶液,观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。

    2、核糖1支试管加入水解溶液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中2分钟。注意溶液是否变成绿色,说明核糖的存在。

    3、磷酸 1支试管,加入水解液1mL和定磷试剂1mL.在水浴中加热30min,观察溶液是否变蓝色,说明磷酸是否存在。

    .酵母RNA含量测定

    定磷法:

    用浓硫酸将核酸消化,使其中的有机磷氧化成无机磷,而无机磷与定磷试剂中的钼酸铵反应生成磷钼酸铵,在一定酸度并有还原剂存在的条件下,其中的高价钼被还原成低价钼,从而生成深蓝色的还原产物——钼蓝。

    H3PO4+12H2M0O4H3P(M03O10)4+12H2O

    钼蓝在660nm处有最大的光吸收值,在一定的磷浓度范围内,蓝色的深浅与磷的含量成正比。为了求得含磷量与吸光值之间的关系,必须先用标准无机磷溶液(KH2PO4)与定磷试剂反应,作出无机磷含量与吸光值关系的标准曲线。

    为了消除核酸样品中原有无机磷的影响,应同时测定未消化核酸样品中的无机磷,并从总磷量中减去此无机磷量,才能代表核酸中真正所含的磷。

    定磷法准确性好,灵敏度比较高,最低可以测定到每毫升10ug核酸的水平,因此可作为紫外吸收法和定糖法的基准方法。

    【一】原液配制

    RNA样品配成5mg/mL溶液

    250mgRNA样品加少量氨水,<5mL,助溶

    用水定容至50mL,作为原液待用

    使用时根据需要进行稀释,如需要浓度为100g/mL,则稀释50倍即可.

    (二)试剂配制

    1、标准磷溶液

    KH2PO4预先置于105℃烘箱中,烘至恒重,放于干燥器内,降至室温。准确称取约0.1295g(含磷50mg,用水溶解,定容至50mL(含磷量为1mg/mL)。

    作为贮存液置于冰箱中待用。测定时,取此溶液稀释100倍,使含磷量为10ug/mL

    2、定磷试剂

    3mol/L硫酸:水:2.5%钼酸:10%抗坏血酸=1211(按此顺序加入)

    35mol/L硫酸

    430%H2O2

    (三)实验操作
    1、标准曲线的绘制







    标准磷溶液(mL



    (mL)



    相当于无机磷量(ug



    定磷试剂(mL)



    1



    0.0



    3.0



    0.0



    3.0



    2



    0.2



    2.8



    2.0



    3.0



    3



    0.4



    2.6



    4.0



    3.0



    4



    0.6



    2.4



    6.0



    3.0



    5



    0.8



    2.2



    8.0



    3.0



    6



    1.0



    2.0



    10.0



    3.0



    将试管中溶液摇匀,45℃恒温水浴,保温25min,冷却至室温,在660nm处测定光吸收值。

    2)取两次平行操作的平均值,以标准磷含量(ug)为横坐标,以光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。

    2、测总磷量

    2个微量凯氏瓶,1号瓶加0.5mL蒸馏水作空白对照, 2号瓶加入0.5mL制备RNA原液(5mg/mL, 2.5mg/RNA);

    2个微量凯氏瓶中各加1.5mL,5mol/LH2SO4,置于电炉上消化4h,待溶液呈黄褐色后,取出稍冷;

    230%H2O2,继续消化,至溶液透明为止,取出冷却;

    0.5mL蒸馏水,再沸水浴10min,以分解消化过程中形成的焦磷酸,然后将凯氏瓶内容物定量转移到50mL容量瓶内,定容;

    4支试管分两组,分别加1mL消化后定容的样品和空白溶液,进行定磷比色测定,从标准曲线中查出磷酸的g数,再乘以稀释倍数即得每mL样品中的总磷量。

    3、测无机磷量

    2支离心管,其中1支加水0.5mL,另1支加0.5mLRNA溶液。

    2支试管中各加0.5mL沉淀剂,3000r/min离心15min

    取上清0.1mL,加2.9mL水和3mL定磷试剂, 比色测定, 由标准曲线查出无机磷的g, 再乘以稀释倍数就得每mL样品中的无机磷的g数。
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  • 梁不凉

    第1楼2021/11/30

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